五加科药用植物悬浮培养技术研究进展

宋娟，雷秀娟，尹红新，王英平

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

五加科(Araliaceae)药用植物多分布在山林深处，其中不乏有多种名贵中药材，如人参(PanaxginsengC.A.Mey.)、西洋参(P.quinquefoliumL.)、三七(P.notoginseng)、东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)、刺五加(EleutherococcussenticosusMaxim.)和龙牙楤木[Araliaalata(Miq.)Seem.]等，具有抗衰老、降血脂、滋补、活血补气、利脾补肾等作用[1]。但是由于该科药用植物多数生长周期较长，使得对其形态学等基础研究存在很大局限性。1964年，罗士韦等[2]对人参愈伤组织培养进行研究，开启了五加科药用植物离体培养的大门，这为解决五加科植物的形态发生、遗传育种、种质创新等研究提供了技术手段。从此，五加科药用植物悬浮培养技术研究成为了该领域的新热点。

1 五加科药用植物悬浮培养的特点

植物悬浮培养指在液体培养基中震荡培养细胞或组织等。植物细胞或组织悬浮培养不受季节、土壤等外界因素的影响，在培养过程中细胞、悬浮不定根及毛状根等生长迅速、来源单一、遗传稳定、代谢产量高[3～5]，易于同步化，可以大大缩短生长周期。五加科药用植物悬浮细胞具有细胞易粘附聚集的特点，主要发生在细胞培养前期和对数后期，分别是由于前期迅速分裂的年幼细胞不能及时分开及对数后期分泌的多糖和蛋白质会使细胞相互粘附的结果。

2 影响五加科药用植物悬浮培养的因素

2.1 生长周期

五加科药用植物悬浮培养的最适生长周期一般为30d，周期基本呈“S”型。人参[6]、西洋参[7]等植物细胞0d～5d先进入延迟期，10d～15d开始进入对数期，人参细胞在第24天、西洋参细胞第30天左右时分别得到最大生长量和皂苷含量；刺五加[8]的延滞期较长，需0d～12d，第20天、第40天时分别得到生长速率和最大生长量，在进入对数期后细胞量开始增加，稳定期后产量达到最大值。

2.2 接种细胞和初始接种量

五加科药用植物细胞悬浮培养一般选择嫩黄色、质地疏松、呈透明状态的旺盛时期的愈伤组织进行实验，此类细胞处于快速生长期，体积小、分裂快、易分散，适合建立悬浮培养系。初始接种量在建立悬浮培养体系时有重要作用，细胞接入量过多影响培养物增殖，会短期内消亡；接入量少时，不利于培养物正常生长。不同植物的初始接入量也不完全相同。例如王娟[9]对西洋参接种量进行了研究，认为接种量为25g/L～35g/L时利于西洋参细胞生长，有最大细胞干重，随着接种密度增加，细胞生长率下降；低于20g/L的接种量时，细胞增殖受抑制。刺五加细胞悬浮培养的最佳接种密度为60g/L，培养过程中细胞生长良好，并得到最大生长量[8]。

2.3 pH

悬浮培养体系中，影响细胞生长的一个重要参数是pH。一般五加科植物细胞或组织悬浮培养pH为5.8～6.0，也有人认为pH在小范围内波动对细胞生长影响不大，但对次生代谢物的积累有很大影响。悬浮培养周期里，pH也随着营养物质消耗和代谢物的积累发生变化，进入延滞期后pH下降，进入对数期后开始缓慢上升，直到稳定期后pH迅速增加到最大值。

2.4 培养基成分

2.4.1基本培养基研究发现，在1/2 MS和MS培养基浓度时，能促进人参细胞[10]、不定根的生长，浓度过高则有抑制作用，其中MS培养基最有利于西洋参细胞生长和皂苷积累；B5培养的细胞增殖率最低，但能促进人参皂苷和多糖的合成；White、Fox、6，7-V等培养基对细胞增殖影响不大，但利于一些代谢产物的积累[9，11]。刺五加嫩叶愈伤组织悬浮培养时，在MS培养基上长势最好，40d细胞增殖6倍多，细胞团增大明显；B5稍差；1/2 MS长势最差，且有自溶现象[8]。

氮源是基本培养基中对五加科药用植物悬浮培养影响最大的因素。氮源总浓度一定时，NO3-/NH4+的比值高，人参[12]、西洋参[13，14]、三七和刺五加[8]的生长速率和细胞含量显著增加；当只有NO3-时，也有利于细胞生长且皂苷和多糖产量达到最大值；只有NH4+时或浓度高于20mmol/L时，人参细胞生长受抑制，甚至不生长。又有研究认为，NO3-和NH4+同时存在时，人参悬浮细胞可获得最大细胞生长量[6]。

磷酸盐对植物的细胞生长有较大影响。东北刺人参不定根的鲜物重和干物重及增殖系数随磷酸盐浓度的增加，先增加后降低；当浓度是正常MS培养基的浓度时获得最大值[15]。当磷浓度为1.04mmol/L时，人参细胞有最佳生长；浓度为0.42mmol/L时，皂苷产量最高。西洋参的最佳细胞生长浓度是0.65mmol/L，皂苷产量最高的浓度为1.25mmol/L[16]。三七[17]悬浮培养中，磷起始浓度增大明显利于细胞生长，2.5mmol/L时细胞达到饱和生长量，3.75mmol/L可获得最佳细胞培养和最大皂苷含量。

培养基中其他离子对五加科植物悬浮培养也有一定影响。Mg2+可以激活一些酶的活性，浓度为92.5mg/L时可以提高西洋参悬浮细胞的生长速度；浓度为55.35mg/L的Ca2+可以促进培养物生长和皂苷产量的增加[18]。三七悬浮培养的细胞生长，随Cu2+浓度增加而增加；浓度低于25μmol/L的Cu2+对人参不定根无明显作用。

2.4.2碳源糖不仅是培养液中碳源的主要来源，还有维持培养基渗透压的作用。糖浓度过低，不足以满足细胞生长、发育、代谢和维持渗透压的需要；过高的糖量导致细胞失水，不利于细胞生长。蔗糖是建立五加科悬浮体系最常用的碳源，与葡萄糖和果糖相比，蔗糖和白糖更利于东北刺人参不定根的鲜物重和干物重的增加[15]。在刺五加[8]悬浮培养中发现，糖浓度对细胞生物量的积累趋势无明显影响，但在高、低浓度时，分别导致细胞死亡、干重下降和生长缓慢；在中、高浓度时，细胞生长良好，干重率明显增加，糖最适浓度为40g/L。30g/L～50g/L蔗糖时，人参细胞快速生长，有最大生长量；40g/L蔗糖浓度对三七细胞生长有利，但超过60g/L时抑制生长[10，17，19]。

2.4.3激素植物激素对五加科药用植物的悬浮培养至关重要，因而对不同激素浓度的筛选十分必要。Choi等[20]发现，刺五加胚性愈伤组织在不含2，4-D的MS液体培养基中比含4.5μM 2，4-D的MS固体培养基上更易诱导出体细胞胚。龙牙楤木细胞培养在含1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中会大量增殖，且生活力强[21]。IBA可促进人参、西洋参等悬浮培养细胞的生长和皂苷积累；2，4-D有利于人参、西洋参[22]、三七、刺五加等细胞的生长；NAA能促进人参发状根的生长，IBA利于细胞、发状根生长。人参细胞悬浮培养中，激素对细胞生长量的影响效果均依次为2，4-D>NAA>BA>KT，7mg/L的IBA与BA或KT混用时，可以促进悬浮细胞的生长[23]。有利于三七细胞生长的2，4-D浓度是0.5mg/L～1.0mg/L，也可以提高皂苷含量；NAA和IAA都会抑制竹节参(PanacisJaponiciRhizoma)发根的生长，干重、湿重比明显降低，而IBA则有促进作用[24]。

2.5 诱导子对五加科悬浮培养的影响

诱导子指能够诱导植物产生抗病性的物质。从来源上可分为生物和非生物诱导子。生物诱导子包括多种P(真菌、细菌、病毒和酵母)，非生物诱导子包括水杨酸、寡糖素、茉莉酸甲酯、前体、温度等[25]。

2.5.1生物诱导子诱导子在人参不定根[26]等组织中作用24h后，可提高皂苷等活性物质含量；经刺盘饱菌丝体处理的西洋参细胞，总皂苷产率提高1.3倍；黑曲霉可增加细胞多糖含量达1倍多[27]。方绮民等[28]发现，6种真菌菌丝体能促进西洋参悬浮细胞的皂苷合成，作用最明显的是葡枝根霉菌丝体。

刘峻等[29]发现，黄瓜炭疽病菌、青菜炭疽病菌、棉花枯萎病菌及黑曲霉中提取的真菌诱导子对人参毛状根某些皂苷的合成具有特异性，能促进次生代谢物的定向积累，还对生物量有影响。如黑曲霉多糖诱导子浓度为20mg/L时，可以促进毛状根生长和总皂苷含量增加，单体皂苷Rg2和Rb1含量增加，未检测出Rg1和Re。

初旸[8]利用从土壤中分离的黄瓜炭疽、番茄灰霉、编号2020、编号2006及编号2014的5种真菌作为诱导子(后3种为未知菌种)，考察对刺五加愈伤悬浮系的影响。结果表明，5种真菌诱导子均可使培养基pH上升；黄瓜炭疽、2020和2014轻微抑制生长；番茄灰霉和2014在提高总皂苷的含量上有显著作用；2020明显刺激多糖的合成积累。

2.5.2非生物诱导子Shohael等[30]发现，不同光源下，刺五加体细胞胚的不同代谢物含量比暗培养时增加，部分酶活性提高。红光下，刺五加皂苷E和E1大量积累，丙二醛、过氧化氢等的含量及抗氧化酶活性增加；荧光灯下，可以提高总黄铜、总酚类等含量及抗坏血酸过氧化物酶活性。

温度对五加科植物悬浮培养有一定的影响。热处理可以提高人参细胞生长速率，但培养前期细胞成活率低。人参不定根皂苷积累最适宜的温度是25℃；白天20℃、晚上13℃时有利于不定根生物量的增长[31]。Shohael等[32]发现，在低温(12℃)和高温(30℃)的反应器中，会抑制刺五加体细胞胚的生长，石碳酸、类黄酮等含量也会下降。

水杨酸对人参发根的生长和总皂苷的积累均无明显的促进作用，且随其浓度的增高反而出现抑制作用，即使水杨酸浓度为0.1mmol/L时，总皂苷产量也仅达到0.1008g/L；较低浓度的茉莉酸甲酯促进总皂苷的积累和人参发根的生长；适当浓度的水杨酸和茉莉酸甲酯能促进Rb1的积累，但效果不明显[33]。当水杨酸的浓度是0.6mg/L时，西洋参发状根达到生长量和皂苷含量的最大值；茉莉酸甲酯对皂苷合成及折干率有较明显影响[34]。寡糖素可以促进人参、西洋参、三七等的悬浮物的生长和皂苷积累，特别是西洋参里Rg组皂苷。

皂苷类活性物质的合成也受前体的作用，特别是作用于其合成途径的前体。张美萍[11]实验了甲羟戊酸、L-亮氨酸、醋酸镁和辅酶A4种前体对西洋参芽胞愈伤悬浮培养的影响发现，除甲羟戊酸外，其它前体物都能促进生长，一定浓度的ATP对西洋参悬浮细胞生长和皂苷合成有促进作用。

3 反应器培养

悬浮培养增殖速度快、培养物同步化、培养量大的特点为植物细胞进一步进行的生物反应器培养提供了条件，而植物反应器培养是实现产业化的前提。日本实现了人参细胞的工业化生产，这是五加科植物最早进行的反应器培养。

80年代，周立刚、郑光植等先后对人参、西洋参、三七用机械搅拌式发酵罐进行了大量培养，pH 5.8左右时，利于细胞生长和皂苷积累。Woragidbumrung、Hu[35，36]进行了三七的反应器培养发现，改良的MS培养基可提高细胞生长率、细胞产量及皂苷和多糖含量；人参寡糖素可使三七的发酵培养提前进入对数生长期、指数生长期，并明显作用于该时期和促进细胞产率增加。

在空气提升和旋转式的生物反应器中，食用土当归(AraliacordataThunb.)体细胞胚的悬浮培养的增值率最高；在500L的发酵罐中，悬浮培养食用土当归的细胞含量增加数十倍，并可获得55倍的花青素[37，38]。在鼓泡塔反应器中，悬浮培养刺五加胚性愈伤组织成功转化生成植株，转化率达64.7%[39]。

自王冲之等最先建立了西洋参发根系统培养后，研究发现，SJ-1和B5培养基可以促进发根生长，水解乳蛋白和激素IAA、IBA等利于毛状根的增殖，水解乳蛋白还能增加皂苷含量。低温可增强刺五加体细胞胚的耐低温性和细胞膜的稳定性[40]；30%～40%的通氧量促进人参不定根的增殖[41]。

4 展望

近年来，五加科药用植物的悬浮培养技术已经取得了飞速的发展，对影响其悬浮培养的因素的研究已比较系统，部分药用植物的大规模悬浮培养的研究也有了很大进展。作为拥有较多五加科药用植物的国家，我国在该科植物悬浮培养方面虽有了一些成果，但仍需进一步地深入研究：通过物理和化学的培养因子各自或相互作用，提高悬浮培养物的生物量及活性成分含量，为其他研究获取更多实验材料；与其他技术相结合，例如分子生物、基因工程、辐射、生物转化等来建立高产无性系，得到优质的品系，丰富五加科药用植物资源；反应器培养是实现五加科植物悬浮培养的工业化的关键，筛选反应器、优化培养条件等建立优质的悬浮培养体系，获得更多的五加科植物活性成分。

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