低压电刺激对牦牛肉宰后成熟过程中嫩度及肌纤维超微结构的影响

田 园，孙志昶，余群力,，张文华，杨 勤

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.宁夏厦华肉食品有限公司，宁夏 中卫 755000；3.甘南州畜牧科学研究所，甘肃 合作 747000）

牦牛（yak）主要分布在我国低气压、高海拔、暖季短、冷季长的高寒高山草原[1]。甘南位于青藏高原和秦岭山地的过渡地带，平均海拔3 000 m左右，草场资源丰富，无污染，是广受消费者青睐的天然绿色食品[2]。但近年来牦牛肉的嫩度、多汁性等品质指标严重制约了甘南牦牛肉的内销和出口。牦牛肉肌纤维较粗，在冷藏过程中会发生僵直现象，这些因素都导致了牦牛肉的适口性和嫩度较差[3]。

电刺激（electrical stimulation）通常应用在牛肉和羊肉生产中，可以有效防止冷藏过程中的僵直现象[4]。此外，电刺激还可以有效提高肉的色泽，缓解肉的热环现象[5]。2003年Hwang等[6]指出电刺激可以通过加快糖酵解和降低pH值来防止冷收缩，破坏肌纤维结构，加快肌肉组织的溶解，从而改善肉的嫩度。

1977年Dutson等[7]首次发现电刺激改变了牛背最长肌的超微结构，出现大量挛缩带，破坏了肌节结构；此外，在1982年Sorinmade等[8]指出电刺激处理会使超过30%的肌肉的超微结构被破坏（60 Hz，145～250 V，2 min），这对肉的嫩化起着重要作用；2002年Hwang等[9]发现对牛胴体进行频率分别为14.3 Hz（宰后45 min，800 V，55 s）和36 Hz（45 V，宰后立即处理，45 s）的电刺激，肌节的收缩程度分别是89%和55%。

本实验研究不同电刺激时间处理对牦牛肉成熟过程中剪切力、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）及肌纤维超微结构变化的影响，探索寻找最佳牦牛肉宰后处理工艺，以期为中国牦牛肉产业化、品质的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

随机选取20头自然放养条件下健康的3～5岁甘南公黑牦牛，由自临夏市清河源清真食品有限责任公司提供，体质量为（300±50）kg，宰前禁食禁水。

氯化钾、磷酸钾、EDTA、氯化镁、叠氮钠、戊二醛、四氧化锇、乙醇、醋酸双氧铀、柠檬酸铅，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

C-LM4型数显式肌肉嫩度仪 北京天翔飞 域仪器设备有限公司；FA2004B电子天平 上海佑科仪器有限公司；756P紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪 有限公司；ES-4型电刺激仪 查韦斯机械制造（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组

电刺 激处理组（electrical stimulation and chilling，ESC）：牦牛刺杀放血后，在10 min内采用查韦斯机械制造有限公司生产的ES-4型电刺激仪进行电刺激（输出电压为21V，额定功率为50 W），电刺激时间分别为72、90、108 s。常规冷却排酸组（normal chilling，NC）：牦牛经正常屠宰流程屠宰。两组屠宰后胴体劈半，置于0～4 ℃、风速0.5 m/s环境下成熟。在成熟过程中的第0、1、3、5、7、9天取背最长肌，测定其剪切力、MFI、肌纤维超微结构。

1.3.2 剪切力测定

取形状规则（5 cm×5 cm×5 cm）的肉样，水浴至中心温度75 ℃后取出肉块，冷却至室温，顺着肌纤维方向用直径1.27 cm的取样器钻取3个肉柱，用压力仪测定每个肉柱的剪切力值，取平均值。

1.3.3 MFI测定

称取2 g新鲜背最长肌肉样，与8 mL MFI缓冲液（100 mmol KCl、20 mmol K3PO4、1 mmol EDTA、1 mmol MgCl2、1 mmol NaN3，pH 7.1）均质，在1 000×g离心15 min，弃去上清液，沉淀用8 mL MFI缓冲液混合均匀后于1 000×g离心15 min，弃去上清液。沉淀再与10 mL MFI缓冲液混合，用200目筛子过滤，所得滤液采用双缩脲法测定蛋白含量，用MFI缓冲液稀释蛋白质量浓度到0.5 mg/mL，在540 nm波长处测定吸光度，所得结果乘以200，得MFI值[10]。

1.3.4 肌原纤维超微结构测定

取各时间点的新鲜背最长肌肉样，用刀片顺着肌纤维方向切成2 mm×1 mm×1 mm的小块，用2.5%的戊二醛固定液进行固定24 h以上，再将样品修剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，在1%OsO4固定液中二次固定1 h。随后用体积分数50%、70%、80%、90%、100% 的乙醇脱水。用Epon812树脂包埋，随后将样品放入60 ℃恒温箱内3 d。用超薄切片机制备超薄切片，再用2%醋酸双氧铀和6.18%柠檬酸铅溶液进行染色。最后在透射电镜下观察肌原纤维超微结构。

1.4 数据处理

所得测定数据，用SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理，用Origin作图软件进行图形制作。

2 结果分析

2.1 不同电刺激时间对牦牛肉宰后成熟过程中剪切力的影响

由图1可知，不同处理组的牦牛肉在宰后成熟过程中剪切力呈下降趋势，ESC处理组的成熟时间明显比NC的时间短，且在不同电刺激时间作用下，ESC90 s处理组成熟时间最短，ESC72 s处理组次之，ESC108 s处理组相对最长。在宰后0 d，采用ESC108 s处理组的牦牛的背最长肌的平均剪切力值要比其他处理组高，可能是由于长时间的电刺激导致牦牛肉发生热收缩，使肉韧化[11]，而在之后的成熟过程中ESC处理组的剪切力值迅速下降，且都低于NC，在第9天，与NC组相比，电刺激组分别比NC低12.9%、17.9%和5.9%（P＜0.01）。

图1 不同电刺激时间作用下牦牛肉剪切力的变化Fig.1 Effect of electrical stimulation time on the shear force of yak meat during postmortem aging

2.2 不同电刺激时间对牦牛肉宰后成熟过程中MFI的影响

图2 不同电刺激时间作用下牦牛肉MFI的变化Fig.2 Effect of electrical stimulation time on the MFI of yak meat during postmortem aging

MFI值反映了肌纤维被降解及破坏的程度[12]，越大，肌纤维破坏程度越大，即肌纤维破碎程度越严重，相应的剪切力值越小，嫩度越好，因此，MFI值与肉的嫩度密切相关。由图2可知，不同处理组的牦牛肉在宰后成熟过程中MFI呈上升趋势，ESC处理组的MFI的上升速度普遍比NC快，MFI值的增加被认为是μ-钙激活酶作用的结果[13]，电刺激使肌浆网破裂，钙离子释放，激活了钙激活酶，使MFI快速升高；且在不同电刺激时间作用下，ESC90 s处理组的MFI值上升最快。在宰后0 d，ESC90s处理组的牦牛肉MFI平均值分别比其他处理组高18.87%、46.65%和18.08%；ESC108 s处理组的牦牛肉MFI值最低，这与图1中ESC108 s处理组的牦牛肉在宰后0 d剪切力值最高相符，可能是由于长时间的电刺激导致牦牛肉发生热收缩，使肉韧化[11]，随后各处理组的MFI值随着成熟时间的延长开始上升，ESC90 s处理组的MFI值上升最快，NC最慢。第9天ESC108 s和NC处理组的MFI值达到了103左右，且相差不大没有显著性差异；ESC72 s和ESC90 s处理组分别比NC组高7.71%和9.86%。

2.3 成熟过程中MFI与剪切力的线性回归分析

表1 成熟过程中不同电刺激时间MFI和剪切力线性回归分析Table 1 Regression analysis between MFI and shear force with different electrical stimulation times

由表1可知，不同处理组在成熟过程中剪切力和MFI呈线性相关（P＜0.01），表明了牦牛肉在宰后9 d的成熟过程中，嫩度与肌纤维的降解密切相关。

2.4 不同电刺激时间对牦牛肉肌纤维超微结构的影响

图3 不同电刺激时间对宰后0 d牦牛肉背最长肌肌纤维超微结构的影响Fig.3 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 0 d postmortem

由图3可知，宰后0 d，NC组肉样的肌纤维超微结构显示正常，排列有序，亮带、暗带、Z线、M线排列整齐、清晰。然而ESC处理组中有挛缩带（B：1；C：1）和拉伸带（B：2；C：2、3；D：1）的形成，肌节长度明显收缩，肌纤维的正常排列被破坏，肌节间隙变宽，且在一定范围内相邻Z线重叠，出现不规则形变，且单个肌纤维观察上去呈现两头单薄中间粗厚的形状，与NC组相比，ESC处理组的肌纤维直径分别是NC组的57.47%、68.97%和80.46%，这与Hwang等[9]的研究结果相符，其研究指出电刺激可以改变肌纤维的正常排列，出现挛缩带，且改变了肌节形状，使肌纤维直径变小，肌节间隙变宽，使肌节的收缩可以达到55%。

由图4可知，牦牛宰后成熟5 d，肌纤维结构被破坏。NC组肉样中部分Z线被蛋白酶降解，发生了断裂，导致部分及纤维在亮带处发生断裂，有少量Z线残骸出现；而ESC处理组中肌纤维结构被严重破坏，甚至在一定范围内肌纤维被溶解，临近挛缩带的区域Z线被溶解甚至消失，M线模糊不清；在非挛缩带中，肌纤维大面积断裂、溶解，出现了肌原纤维小片[14]，这与MFI值的升高相符。ESC处理组肉样在电子显微下观察到分别有14%、21%和12%的肌纤维被溶解。

图4 不同电刺激时间对宰后5 d牦牛肉背最长肌肌纤维超微结构的影响Fig.4 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 5 d postmortem

图5 不同电刺激时间对宰后9 d牦牛肉背最长肌肌纤维超微结构的影响Fig.5 Effect of electrical stimulation on myofibrillar structure of yak M.longissimus at 9 d postmortem

由图5可知，牦牛宰后成熟的第9天，肌纤维遭到严重破坏。NC组中有22%的肌纤维被溶解，M线变得模糊不清，肌节间隙明显变快；ESC处理组中肌纤维发生大面积破坏、溶解，ESC72 s处理组中有高达47%的肌纤维被溶解，出现了大量肌原纤维小片，Z线断裂程度加重；ESC90 s中肌纤维结构被完全破坏，挛缩带内肌纤维直径变大，亮带、暗带界限消失，Z线、M线溶解消失，整个区域模糊不清，这与Dutson等[7]的研究结果一致；ESC108 s处理组在电子显微镜下观察到有36%的肌纤维被溶解，平均肌纤维直径为1.2 μm，Sorinmade等[8]研究指出，牛肉经电刺激处理后，随着冷却排酸的进行，肌纤维结构发生改变，被逐渐降解破坏，在成熟的第7～10天，有20%～40%的肌纤维被破坏降解，与本实验研究结果一致。

3 讨 论

电刺激作用可以明显加速宰后牦牛肉成熟过程中剪切力的下降，即加速了牦牛肉的嫩化过程；而对比不同电刺激时间，可以发现ESC90 s处理组的剪切力下降速度最快，嫩化过程最短，在宰后第7天即可达到最低水平；而最终值，电刺激组比NC组分别低12.9%、17.9%和5.9%。2010年Gursansk等[15]通过研究发现，电刺激作用对牛肉的嫩化效果明显，且不受牛种差异的影响，甚至经电刺激处理的硬牛肉比天然的牛肉嫩度还要好。关于电刺激嫩化肉品的机理，国内外学者众说纷纭，但是普遍认为是由以下两方面引起：一方面，电刺激加速了肌浆网内钙离子的释放，导致了肌纤维发生收缩，改变了肌纤维超微结构[16]；另一方面，电刺激处理导致的宰后胴体高温低pH值加强了酶活性，加速了蛋白的降解[17]。这与我们观察到的肌纤维超微结构结果一致。

电刺激作用可以加快牦牛肉宰后MFI值的上升速度，而且ESC处理组的MFI值较NC组上升快，ESC90 s处理组中初始的MFI值分别比其他处理组高18.87%、46.65%和18.08%，且最终值ESC处理组要高于NC组。这就说明了电刺激作用加剧了牦牛肉宰后成熟过程中肌原纤维小片化的程度。2011年Bjarnadóttir等[18]通过实验证实牛肉经电刺激处理会使其中的不溶性蛋白发生改变，具体指牛肉经电刺激处理后，其长链蛋白减少，而小分子蛋白增加，这正好证明了该实验中MFI值上升的原因。MFI值的增加正好可以反映牦牛肉成熟的进行。因此，电刺激处理对改善牦牛肉的嫩度有明显作用。

通过肌纤维超微结构可以发现，电刺激作用可以改变牦牛肉肌纤维结构排列，甚至破坏肌纤维结构，形成了挛缩带和拉伸带，随着成熟时间的延长，逐渐出现了肌原纤维小片，这与MFI值的上升相符。1977年Dutson等[7]首次发现，电刺激处理的牛的背最长肌，其挛缩带是通过肌节的拉伸和形变形成的。Geroge等[19]随后在1980年发现牛胴体经电刺激处理后（700 V，25 pps，2 min宰后），其挛缩带的出现是因为电刺激诱导的局部肌浆网钙离子的过量释放导致的肌肉强直收缩的结果，挛缩带对肌纤维超微结构的破坏作用降低了剪切力，改善了嫩度。而Savell等[20]研究指出电刺激处理改变了肌节长度，主要是因为挛缩带的作用，在挛缩带形成的区域，I线和Z线排列极不规则，挛缩带相邻的区域肌节长度发生改变，因此出现了肌节的拉伸和收缩。

4 结 论

电刺激作用加速了宰后牦牛肉成熟过程中剪切力的下降，第9天，ESC处理组的平均剪切力分别比NC组低12.9%、17.9%和5.9%；加快牦牛肉宰后MFI值的上升，第9天，ESC72 s和ESC90 s处理组分别比NC组高7.71%和9.86%。电刺激作用破坏了肌纤维结构，肌节直径明显收缩，分别是NC组肌节直径的57.47%、68.97%和80.46%；有高达47%的肌纤维被溶解，这与Sorinmade等[8]的研究结果一致。不同处理组在成熟过程中剪切力和MFI呈线性相关（P＜0.01）。因此，电刺激可以显著改善毛牛肉嫩度，促进牦牛肉的成熟，具有广阔的市场前景。在本研究基础上，后期研究可通过对其细胞形态、线粒体形态以及蛋白降解进行研究，进一步阐明电刺激嫩化牦牛肉的机理。

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