肝癌组织端粒酶活性与肝癌病理类型关系的研究

吴小溪，米志宽

（延安大学医学院，陕西延安716000）

肝癌组织端粒酶活性与肝癌病理类型关系的研究

吴小溪，米志宽

（延安大学医学院，陕西延安716000）

目的研究肝癌组织端粒酶活性与肝癌病理类型之间的关系。方法原发性肝癌分为4种病理类型：块状型、结节型、小癌型和弥散型。端粒酶活性用端粒酶PCR－ELASA法检测。结果89.4％（42／47）的肝癌标本可测到端粒酶活性，尽管不同类型肝癌的端粒酶阳性率不同，但差异无显著性（P＞0.05）。结论大多数肝癌标本呈端粒酶阳性，但端粒酶阳性率与肝癌病理类型间无关联。

端粒酶；原发性肝癌；PCR－ELASA

端粒酶（Telomerase）是真核细胞内用于延伸端粒DNA的一种具有逆转录作用的核糖核蛋白酶，能以自身携带的RNA链为模板，以染色体3’末端DNA为引物延伸端粒DNA。端粒是真核细胞染色体的末端结构，为短的重复碱基序列，具有稳定染色体结构和决定细胞分裂次数等功能。正常机体除干细胞和生殖细胞外，没有端粒酶活性，而大多数的癌细胞呈端粒酶阳性［1－3］。本研究用改良的端粒酶活性检测方法对47例不同类型的原发性肝癌（Primary carcinoma of liver，简称肝癌）组织的端粒酶活性表达情况进行了检测与研究。

1 材料与方法

1.1 肝癌标本

肝癌标本分为四型。癌块型：直径＞5 cm，癌结节数目不等；结节型：癌结节直径介于3～5 cm；小肝癌：孤立的直径＜3 cm的结节或相邻两个结节直径之和＜3 cm；弥散型：癌组织弥散分布无明显结节、或者是米粒至黄豆大的结节散布全肝。做端粒酶活性检测的肝癌组织在手术后0.5 h内取材，置氮液中速冻后，转入－80℃冰箱保存。

1.2 端粒酶提取与活性检测

组织标本各取50 mg，在200μl冰预冷的裂解液中匀浆化，置碎冰块上30 min，4℃g离心20min，上清存－80℃备用。端粒酶活性检测用端粒酶PCR－ELISA法，简述如下：每份样品用25μl反应混合液，加入细胞裂解液2μl（含30μg蛋白／ml），加去离子水50μl，用PCR仪（美国Pekin Elmer公司）进行引物延伸与DNA扩增。阴性对照每5μl细胞提取液加1μg／μlRNA酶，37℃作用20 min，再做PCR－ELISA。PCR参数：引物延伸25℃，20 mim；端粒酶灭活94℃，5 mim；热循环变性为94℃、30 s，复性为50℃、30 s，延伸为72℃、90 s；30个循环后，加入5μl扩增产物，室温孵育10 mim后加入225μl DIG标记探针，混匀。取上述混合液加入用亲和素预包被的微量反应板，每孔100μl。37℃下300 r／min摇床培养2 h。弃去杂交液，250μl洗液洗3次，每次30 s，甩净孔内液体，每孔加100μl抗DIG－POD，300 r／min摇床37℃培养30 min，甩干反应板，加TMB液（含DIG底物）100μl，室温显色15 min。最后每孔加100μl终止液，用酶标仪（DG5031型，华东电子管厂产品）在波长450 nm处测吸光值（A）。（样品A值／阳性对照A值）＞2.0为阳性。

1.3 统计学分析

用χ2检验。χ2值用Pearson的检验公式计算，α值定为0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

不同类型的肝癌病理组织检测到的端粒酶活性总阳性率为89.4％（42／47）。其中块状型肝癌的阳性率为88.9％（16／18），结节型肝癌的阳性率为94.1％（16／17）小癌型肝癌的阳性率为81.8％（9／11），弥散型肝癌的阳性率为100％（1／1）。经χ2检验分析，不同类型肝癌组织的端粒酶阳性率之间没有显著性的差异（P＞0.05），见表1。

表1 肝癌组织端粒酶活性与病理类型的关联

3 讨论

1989年，Morin首先在HeLa细胞中发现了端粒酶，此后，Counter等在腹水转移的卵巢癌中检测到了端粒酶活性，从而引起了人们对端粒酶与恶性肿瘤关系的重视。1994年，Kim等建立了TRAP法检测端粒酶的活性。由TRAP法又衍生出了端粒酶的PCR－ELISA检测法，该方法具有敏感性高、特异性高和快速简便等优点，是迄今国际上最常用的端粒酶活性检测方法。国内外的研究证实，正常机体细胞除造血干细胞和生殖细胞外，一般没有端粒酶活性，但恶性肿瘤有90％以上呈端粒酶阳性，端粒酶活性的表达是癌细胞无限增殖的必需条件。

20世纪90年代以来，肝癌已上升为我国人口恶性肿瘤死亡原因之第2位，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌［4］。国内外研究表明，肝癌组织端粒酶活性阳性率在80～100之间，端粒酶活性的表达与肝癌的临床特征和分化程度等无统计学上的关联；但端粒酶检测可作为肝癌的一种辅助诊断手段，并对肝癌预后（术后存活期）判断有一定意义［5－8］。本研究用改良的端粒酶活性检测方法—端粒酶PCR－ELASA法，对不同病理类型的47例肝癌组织的端粒酶活性进行了检测，结果发现，端粒酶活性的阳性率为89.4％；经统计学分析，未发现端粒酶活性的表达与肝癌病理类型之间的关联，因此，端粒酶活性检测可作为肝癌诊断的一个辅助项目，但不宜用于肝癌病理类型之间的区别。

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Study on the relationship between telomerase activities and pathological types of primary carcinoma of liver

WU Xiao-xi，MIZhi-kuan
（Medical College of Yan＇an University，Yan＇an 716000 China）

Objective To study the relation between telomerase activities and the pathological types of primary carcinoma of liver（PCL）.M ethods PCLs were divided into 4 pathological types：massive，nodular，small nodule，and disseminated.Telomerase activitieswere detected with PCR－ELISA method.Results telomerase activitieswere detected in 89.4％（42／47）of the PCL specimen.Although different types of PCL had different frequencies of telomerase expression，statistical analysis indicated that the difference was not significant（P＞0.05）.ConclusionAbout 90％of the PCLs is telomerase positive，however，no correlation is found between the frequency of telomerase expression and the pathological types of PCL.

telomerase；primary carcinoma of liver；PCR

R335.7；Q55

A

1672－2639（2014）01－0004－02

2013－11－20；责任编辑 赵菊梅］