布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

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（1. 山西省阳泉市农业委员会，山西阳泉　045000；2. 山西省动物疫病预防控制中心，山西太原　030027； 3.吉林出入境检验检疫局，吉林长春　130062 ）

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

石丽瑞1，李秀华1，韩惠瑛2，孟日增3

（1. 山西省阳泉市农业委员会，山西阳泉045000；2. 山西省动物疫病预防控制中心，山西太原030027； 3.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062 ）

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针，建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品，进行实时定量荧光PCR反应检测，通过优化反应条件，建立标准曲线。以标准品为模板，对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析，结果表明，该检测体系的检测灵敏度高，重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌，具有良好的应用前景和市场价值。

布鲁氏菌；实时定量荧光PCR； 样本检测

布鲁氏菌病（又称马耳他热）是一种人畜共患传染病，最早对于该病的报道源于19世纪[1-4]。布鲁氏菌主要包括6个种属 （羊、牛、猪、犬、绵羊和沙林鼠种布鲁氏菌），其中，牛、羊、猪、犬种布鲁氏菌为主要的人畜共患菌种[5]。感染该病的典型特征是生殖器官产生炎症、流产、早产、不孕不育等一系列的生殖系统疾病[6-7]。由于布鲁氏菌病隐性病例多，临床上大多不具有明显症状，往往造成对本病的忽视。此外，目前此病并无特效药，对该病以防控为主，因此对该病的检验检测显得尤为重要。目前，对该病菌（布鲁氏菌）的主要检测手段包括两个方面：一是血清学检测，包括沉淀反应、补体结合反应和酶联免疫吸附试验（ELISA）等；二是分子生物学手段，包括DNA 探针和PCR检测。前者适用于大规模快速检测，后者适用于定性检测。因此本研究致力于建立敏感、准确的布氏杆菌实时定量荧光PCR检测方法。

1　材料与方法

1.1材料不同种属的布鲁氏菌菌种购自中科院或由本单位保存；对照菌株等均购自中国兽医药品监察所；疑似布鲁氏菌病的血液或组织样品由吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心协助采集；引物和探针由上海生工合成与制备；蛋白酶试剂均为Sigma公司产品；如无特殊说明，其它相应化学试剂（分析级）均购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1目的基因的确定、引物设计与合成

通过大量查阅文献及资料，并在GenBank搜索相应核酸序列，针对布鲁氏菌基因序列，选取布鲁氏菌膜外蛋白BSCP31基因的特异性保守区段设计特异性引物及探针：上游引物5'-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3’， 下 游引物5'-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3’，探针FAM-TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA，均配制成20 μmol/L，-20 ℃保存。设计好的引物及探针交由上海生工合成与制备。

1.2.2样本DNA提取与制备

1.2.2.1材料处理取新鲜制备（通过培养布鲁氏菌获得）或冰冻临床样本（来自于疑似病例组织或血液）处理组织块0.5～1.0cm3， 并用剪刀剪碎，然后加TE 1mL，并进行匀浆。将匀浆液倒入到2mL离心管中。然后加入20% SDS 25 mL，蛋白酶K （2mg/mL） 25 mL进行消化组织，60°C水浴2.5～3h。

1.2.2.2DNA提取按照常规方法进行，大致过程如下： 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，混和、充分混匀3min， 5000g离心10min，取上层水相到另一1.5mL离心管中。加等体积饱和酚，混匀， 5000g离心10min，取上层水相到另一管中。加等体积酚/氯仿，轻轻混匀， 5000g离心10min，取上层水相到另一管中。加等体积氯仿，轻轻混匀，5000g离心10min，取上层水相到另一管中。加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后， 5000g离心5min，弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤， 5000g离心3min ，弃上清液。室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50～100mL TE溶解过夜。此外，在提取DNA的过程中我们也曾采用商品化的基因组DNA提取试剂盒抽提布鲁氏菌全基因DNA，二者无明显差异。

1.2.2.3模板DNA制备与提取选取引起布鲁氏菌病的2株不同基因型的布鲁氏菌悬液以10000r/m离心2min，弃上清，向沉淀中加入560μLTE缓冲液，反复吹打使之重悬，加入30μL的10% SDS和3μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀，37℃孵育1h；加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/ NaCl溶液，混匀，65℃温育10 min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000 r/min离心5 min，将上清转入一新离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀，10000 r/min离心15min，去上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE缓冲液溶解DNA备用（如不能及时检验，可将上清液于-20 ℃保存；-70 ℃可长期保存）。

1.2.3实时荧光定量PCR检测方法的建立为获得最低Ct值、典型荧光扩增曲线和较高荧光强度的引物和探针最佳浓度，测定提取细菌，选取40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、120ng/ mL 5组浓度；引物、探针浓度：1μM/0.5μM、5μM/2.5μM、10μM/5μM、20μM/10μM，用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。选定60 ng/mL核酸浓度和10μM/5μM引物探针浓度。

1.2.3.125μL反应体系TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；上游引物（10μmol/L）1μL；下游引物（10μmol/L） 1μL；探针（5μmol/L） 1μL；DNA，5μL；ddH2O 4.5μL。

1.2.3.2反应条件根据实验的需要设计两个反应阶段：第一阶段95℃ 15min；第二阶段94℃ 10s、62℃45s，40个循环；荧光收集设置在62℃ 45s时进行。

1.2.4特异性试验

应用建立的荧光定量PCR方法检测牛副结核分支杆菌、大肠杆菌、链球菌DNA，并设立ddH2O作为阴性对照，检测引物和探针的特异性。

1.2.5敏感性与重复性试验

将核酸进行10倍系列稀释，用荧光定量PCR测定方法的敏感性。对同一阳性样品的4个不同稀释度进行3次重复荧光PCR检测，通过组内重复和组间重复的荧光扩增曲线及Ct值变化来评估方法的重复性。

1.2.6临床样本的检测

从送检的样品中抽取30份进行检测，以验证建立的荧光定量PCR方法的有效性。

2　结果

2.1反应体系条件

为了建立良好的实时定量荧光PCR的反应体系，并通过一系列条件的摸索与鉴定，确定了荧光定量PCR的检测体系，结果如图1所示。

图1　反应程序的确立

2.2特异性实验结果

为了验证所建实时定量荧光PCR方法的特异性，我们进行了交叉检测实验。结果表明， 运用本体系检测牛副结核分支杆菌、大肠杆菌、链球菌DNA等结果均为阴性，只有布鲁氏菌检测结果呈现阳性（图2），这表明，建立的实时定量荧光PCR方法的表现出良好的特异性。

图2　特异性实验结果

2.3重复性与敏感性实验结果

为了验证所建实时定量荧光PCR方法的可靠性与重复性，进行了多样本多次检测，结果表明，该方法检测准确性高，重复性好。此外，该检测体系也表现出了良好的敏感性，最低可检测到的下限水平相当于每微升2.0×101拷贝数的标品（图3、4）。

图3　敏感性试验

图4　重复性试验

2.4临床样品检测

为证实所建荧光定量分析体系的准确性，我们对采集的样品进行检测，检测结果与已知结果比较表明检测符合率为100%。结果表明该方法特异性、重复性、准确性均较好，适合用于布鲁氏菌检测。

3　讨论

布鲁氏菌属（Brucella）又称布氏杆菌，属于革兰氏阴性的短小杆菌。该菌分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬种布鲁氏菌6个种，其中，羊、牛、猪等动物最易感染该病，并容易引起流产等一系列严重后果[1-2，8-10]。人类也可以通过接触带病动物产品等感染此病。布鲁氏菌病在世界范围内广泛传播，给人类健康和畜牧业发展造成重大的经济损失。

我国部分地区曾有流行，特别是在50—60年代，现已基本控制。中国流行的主要是羊种、牛种和猪种三种布鲁氏菌，其中以羊种布鲁氏菌病分布最为广泛。我国是该病的高发国家，特别是青海、新疆、内蒙过及西藏等地。该病并无特效药，有效的检测和预防是防控本病的重中之重。因此，研究快速准确并适合临床检测的技术尤为重要。国内外学者也在这方面做了大量的努力，开发了大量的诊断本病的方法，主要包括以下几个方面：（1）病原学检测：本病的病原体的分离培养被认为是本病的黄金标准。这种方法也被认为诊断该病最为可靠的方法。但是这种方法，不仅费时，而且危险，因为需要培养活菌[11-14]。因此，该方法不适合作为普遍的检测方法；（2） 血清学检测：该方法是诊断布鲁氏菌的主要方法，有平板凝集试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等[15-17]，但是血清学检测特异性不强、敏感性差或操作烦琐等缺点。近年来有很多分子生物学方法用于布鲁氏菌检测，包括聚合酶链式反应（PCR），该方法特异性强，敏感性高，并可以用于定性试验。1997年，Mari A等报道建立PCR快速诊断方法[3，18-29]，结果表明该方法特异性高。自此以后，一系列的研究报道使用PCR方法诊断与检测布鲁氏菌。但是，随着PCR技术的发展，出现了荧光定量PCR技术。

在本研究中，我们根据布氏杆菌的保守基因设计引物并合成探针，并建立了荧光定量的分析体系，该检测体系准确性高、重复性好，并表现出了良好的检测敏感性，这说明该检测体系具有良好的潜在应用价值。

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Establishment and application of real-time fl uorescence quantitative PCR system for the detection of Brucella spp

Shi Lirui1，Li Xiuhua1，Han Huiying2，Meng Rizeng3
（1.Yangquan City Agriculture Commission，Yangquan， Shanxi 045000；2.Shanxi Province Animal Disease Prevention and Control Center，Taiyuan， Shanxi 030027；3.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun， Jilin 130062）

According to the conserved sequences of Brucella BCSP31 genes， a pair of specif i c primers and probe were designed and synthesized to establish a rapid and accurate detection system for identif i cation of Brucella by real-time quantitative PCR assay. The prepared Brucella recombinant plasmid containing target gene fragment was taken as the standard in the real-time quantitative fl uorescent PCR， and the standard curve was then established. The specif i city，sensitivity and reproducibility of this detection system were determined with standard as template. Comparison of clinical samples and standard samples showed that the PCR system was of high sensitivity， reproducibility and specif i city. In conclusion， the study established real-time quantitative fl uorescent PCR assay which could be used to detect small amount of Brucella in sample， with sound applicable prospect and quite good market value.

Brucella； real time fl uorescent quantitative PCR； sample detection

S852.614

：A

：1005-944X（2014）01-0057-04