鲤幼鱼饲料中DHA的适宜添加量研究

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

微藻（Microalgae）含有天然生物活性物质，丰富的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质以及抗氧化物质，同时还含有免疫刺激物的特殊成分（Amar等，2004），尤其是富含n-3PUFA，是海洋鱼类等生长、发育的物质基础（Brown等，1997）。近年来，微藻应用于水产动物养殖已经有大量研究，取得了不少成就，但主要集中海洋甲壳类、软体动物以及鱼类。Tan等（2009）利用藻蛋白来替代鱼粉研究Apostichopus japonicus，提高了其生长速度和存活率；Kanazawa等（1977）对牙鲆幼体DHA需求量研究，饲料中适宜添加量为1%。同样，Nandeesha等（2001）对印度鲤饲喂不同水平的螺旋藻能明显改善生长性能。然而富含DHA的藻粉在鲤上的应用研究鲜有报道。本试验拟通过在饲料中添加富含DHA微藻粉对鲤幼鱼生长性能及血液生化指标等影响的研究，探讨鲤幼鱼饲料中适宜的DHA添加比例，为DHA在该鱼种养殖中的应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

DHA藻粉（商品名）由江西泰成生物科技有限公司（南昌）提供，其蛋白质29.2%、粗脂肪51.1%、碳水化合物10.19%、灰分4.34%，DHA 35.5%、DPA 8.13%。试验饲料依据鲤鱼饲料营养标准（SC/T 1026—1998）配制蛋白水平为36.14%、脂肪水平为13.12%的基础饲料。在基础饲料中分别添加0、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的DHA藻粉，用纤维素调节的近似等氮、等能的5种试验饲料（见表1），分别用D1（基础对照组）、D2、D3、D4、D5表示，将试验饲料中各原料充分拌匀后，用SZLH-2制粒机（洛阳）加工成直径为1.50 mm的颗粒饲料，于40℃烘干12 h，-4℃保存备用。

表1 试验饲料组成及营养水平（风干基础）

1.2 试验鱼与饲养管理

鲤幼鱼购于河南省水产科学研究院种鱼繁殖场。选择体格健壮、平均体重（11.31±0.24）g的鲤幼鱼750尾，随机分为5组（Ⅰ~Ⅴ组），每组设3个重复，每个重复50尾，分养于15个规格为1.5×1.2×1.0 m3的塑料桶中，进行为期14 d驯化，驯化期内投喂基础饲料2次（08:30、17:30，按体重的3.5%~4.0%进行投喂）。试验用水为经曝气24 h的自来水，pH值为7.2~7.4，溶氧为6.1~6.6 mg/l，水温由加热棒控温为25~26.5℃；试验期间每日换水1/3，同时收集残饵及粪便。

1.3 试验设计

驯化结束后，Ⅰ~Ⅴ组分别饲喂含微藻粉试验饲料（D1、D2、D3、D4、D5），试验期共60 d。每次投喂结束后，升起食台，收集残饵，烘干并称重。试验结束时停食1 d。试验开始前和结束后分别对Ⅰ~Ⅴ组鱼进行常规生长性能测定。

1.4 测定指标及计算方法

特定生长率（SGR,%/d）=（LnWt-LnW0）×100/t；

蛋白质效率（PER,%）=（Wt-W0）×100（/F×P）；

饵料系数（FCR）=F（/Wt-W0）。

式中：W0——试验开始时鱼体重（g）；

Wt——试验结束时鱼体重（g）；

F——饵料摄入量（g）；

t——养殖试验天数（d）；

P——饲料中蛋白质含量（g）。

1.5 血清的制备及指标测定

生长试验结束后，分别在各试验组中随机抽取6尾试验鱼，心脏抽血，肝素钠抗凝。在室温下放置1 h。并置于冰箱中（4℃）过夜，3 500 r/min离心15 min制得血清，用于测定试验血清生化指标。

血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量由全自动生化分析仪（贝克曼ProCX4，德国）测定；谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZS）、过氧化氢酶（CAT）活性测定由南京建成生物工程有限公司生产的试剂盒，测定方法严格按照试剂盒说明书进行操作；血糖、总胆固醇、总甘油三酯含量采用全自动分析仪（岛津IL-AB6OO，日本）测定。

1.6 数据处理和分析

试验数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Tukey多重比较，差异显著水平为P<0.05。为了预测最佳水平的添加量，采用Zeitoun等（1976）所描述的二次多项式回归分析（Y=aX+bX+c）确定。

2 结果

2.1 鲤幼鱼生长性能（见表2）

表2 DHA对鲤幼鱼生长性能的影响

随添加量增加，SGR、PER先升后降，Ⅲ组最高，显著高于其他组（P<0.05），Ⅲ组SGR比Ⅰ组（对照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组分别提高21.88%、9.2%、5.8%和30.62%，PERⅢ组比Ⅰ组（对照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组分别提高11.49%、6.59%、8.38%和23.57%；SGR、PER在Ⅱ、Ⅳ组之间差异不显著（P>0.05）。Ⅲ组FCR（1.43）显著低于其他组（P<0.05），比Ⅰ组（对照）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组分别降低10.63%、5.92%、7.74%和14.37%；但Ⅱ与Ⅳ组、Ⅰ与Ⅴ组差异不显著（P>0.05）。SGR与DHA藻粉添加量之间回归分析表明，Y=-0.012X2+0.043 7X+2.295 8（R2=0.897 5），最佳添加量为1.82%（含DHA 0.65%）。

2.2 鲤幼鱼血清生化指标（见表3）

从表3可知，不同DHA藻粉添加水平对鲤幼鱼血清的生化指标产生不同的影响。血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量随添加剂量增加逐渐增加，其中试验Ⅳ、Ⅴ组显著高于Ⅰ组和Ⅱ组（P<0.05），但Ⅳ、Ⅴ组间无显著差异（P>0.05）；胆固醇随添加剂量增加先增后降，Ⅴ组显著降于其它各组（P<0.05），分别比Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ降低10.48%、20%、23.3%、15.95%；甘油三酯与胆固醇的情况相似；Ⅱ~Ⅳ组血糖水平差异不显著（P>0.05），但是显著高于Ⅰ组（对照组）（P<0.05），分别比Ⅰ组高0.57%、4.87%、4.30%， 但Ⅴ组血糖则又显著低于对照组（P<0.05），降低10.89%；GOT、GPT活性随添加剂量增加而增加，但添加水平2%（DHA含量为0.71%）以下与对照组无显著差异（P>0.05），添加2.0%（DHA含量为0.71%）或以上则显著增加（P<0.05），Ⅴ组比对照组提高35.89%、39.53%；LZS与相照组对比则随添加剂量增加显著增加（P<0.05），分别增加38.94%、113.11%、144.28%、148.13%，但Ⅳ、Ⅴ组差异不显著（P>0.05）；SOD、CAT在DHA含量小于0.71%添加水平时与对照组无显著差异（P>0.05），大于或等于0.71%则显著增加（P<0.05），Ⅳ、Ⅴ组SOD活性分别比对照组提高5.79%、7.90%，CAT活性提高42.90%、80.03%。

表3 DHA对鲤幼鱼血清生化指标的影响

3 讨论

3.1 DHA对鲤幼鱼生产性能的影响

淡水杂食性鱼类如鲤鱼具有从饲料中将C18∶3n-3的脂肪酸合成自身需要的C20∶5n-3、C22∶6n-3脂肪酸（Bellm等，1986）；而对于海洋食肉鱼类则直接从食物中获取（Buzzi等，1997）。然而外源DHA添加在淡水鱼饲料中研究鲜有报道。王桂芹等（2010）在鲤鱼饲料中添加0.5%~1.5%的DHA，能显著促进生长性能；潘瑜等（2012）在鲤鱼饲料中添加不同脂肪源，结果显示，富含不饱和脂肪酸（DHA）的鱼油组生长性能最好；同样，Steffens等（2007）研究鲤鱼饲料添加较低水平的DHA有显著促生长效应；吉红等（2011）对草鱼研究也得到相似结果。Ren等（2012）研究鲤鱼饲料中添加6.24%的DHA对生长影响差异并不显著。Ahmed Al-Souti等（2012）在对罗非鱼（Oreochromis sp）饲料添加不同水平鱼肝油（含DHA）研究生长性能也显示差异不显著。本试验中，添加1.0%~2.0%DHA藻粉显著提高鲤幼鱼的生长。淡水鱼类对于饲料DHA水平对生长差异的影响可能与物种、生长阶段、饲料脂类的形式和养殖环境有关；而Buchtová等（2010）认为，这种对DHA需求差异可能由于鲤鱼种脂肪酸合成酶基因不同造成，同样Ahmed等（2012）也证实上述观点。

3.2 DHA鲤幼鱼血清生化指标的影响

鱼类血清生化指标变化能快速反映其机体所处的机能状态（吉红等，2010）。血清蛋白水平可以用来衡量蛋白质、氨基酸的合成、代谢、吸收、转运等；本研究中DHA含量在0.35以下（藻粉的添加0.5%~1.0%），鲤鱼的血清蛋白水平与对照组无显著差异，但略有升高，说明饲料组成可满足鲤幼鱼对蛋白质的需求，同时有增强蛋白质转运功能的效果，可能与饲料添加DHA藻粉尤其DHA有关。投喂10%的富含DHA的鱼油或藻粉对于促进鱼类生长、增强免疫在先前研究也得到证明（Subhadra等，2006）。Visentainer等（2005）证实，罗非鱼饲料添加富含DHA鱼油（DHA含量9.9 g/kg）增强血清蛋白水平，并提高肌肉不饱和脂肪酸水平。陈家林等（2011）对异育银鲫饲料添加不同脂肪源（DHA含量不同），结果表明，该鱼能很好地利用低水平DHA，提高血清蛋白水平，尤其球蛋白。投喂DHA增强鱼的血清蛋白水平主要是增强了免疫反应能力（Wiegertjes等，1996）。本试验中，LZS、SOD、CAT水平随DHA藻粉添加量增加其活性持续增大，说明免疫增强，尤其LZS增强迅速。SOD增加显著，显示DHA藻粉诱导机体氧化应激增强，进而影响细胞膜完整性，DHA添加水平过高将损伤鲤免疫系统，与Ji等（2011）对草鱼研究结果相似；同样，于得庆等（2005）对经耐力训练的小鼠也证实DHA对SOD有明显的促进作用；吉红等（2009）利用DHA研究鲤鱼抗氧化活性认为：SOD、CAT增强，可能是机体为了减轻自由基的损伤而产生的一种适应性调节。本试验结果表明，低剂量的DHA（小于0.35%）添加到饲料中，除LZS外，SOD、CAT活性均与对照组相比差异不显著，表明了60 d的饲喂，鲤鱼对含DHA藻粉饲料产生了适应性调节；由于鱼类的特异性免疫系统还不完善，LZS作为鱼类非特异性免疫因子在抵抗感染、应激等中起着重要作用。杨莺劫等（2008）在黄鳝基础饲料中添加DHA，试验结果表明，试验组血清LSZ活性较对照组显著增大；周小秋等（2005）对建鲤鱼饲料不饱和脂肪酸研究也表明，改变n-3和n-6比例显著改变LZS。甘油三酯与胆固醇密切相关，胆固醇的升降影响甘油三酯的升降（何志谦，2000）。Hegested等（1965）也认为，血清胆固醇的变化与PUFA摄取量呈负相关。本研究中血清胆固醇和甘油三酯升降呈现先增加后降低的趋势，说明饲料中低剂量添加DHA藻粉有利于脂质运输，表现出血清蛋白运输系统对饲料的应答效应（Ding等，2010），而高剂量添加n-3系列脂肪酸将阻碍甘油三酯渗入到肝的极低密度脂蛋白颗粒中（闻芝梅，1998），导致肝细胞分泌到血循环中的甘油三酯减少，从而降低血清中甘油三酯的含量（於叶兵等，2012）。通常状态下，GOT、GPT主要分布于肝组织中，血清含量多少与肝组织细胞是否受到应激或损伤有关（Nyb⁃lom等，2004）。本试验中，高剂量DHA含量（1.42%）组GOT、GPT明显高于其他组，说明Ⅳ、Ⅴ组引起鱼体一定程度上的应激反应或损伤，但血糖水平在DHA含量添加水平0.71%以下时差异不显著，说明肝功能相对稳定，而添加1.42%则血糖降低、转氨酶升高表明，肝细胞功能受到不同程度损伤。