张 扬,许 倩,陈 龙,李 欣
(承德医学院基础医学研究所,河北承德 067000)
膜联蛋白A7在胃癌组织中的表达及意义
张 扬,许 倩,陈 龙,李 欣△
(承德医学院基础医学研究所,河北承德 067000)
目的:探讨膜联蛋白A7在胃癌组织中的表达变化和意义。方法:分别采用SP免疫组织化学染色法和Western Blotting法检测膜联蛋白A7在55例胃癌组织和25例癌旁正常胃组织中的表达情况。结果:胃癌组织膜联蛋白A7的表达水平明显高于癌旁正常胃组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:膜联蛋白A7高表达可能参与了胃癌的发生发展。
膜联蛋白A7;胃癌;肿瘤
2003-2007年中国胃癌发病与死亡情况分析报道指出,我国胃癌发病率为33.14/10万,在新发生的各类癌症中居第2位,胃癌死亡率为24.34/10万,居癌症死亡的第3位[1]。膜联蛋白A7是钙依赖性磷脂结合蛋白,属于膜联蛋白A家族的成员,具有参与细胞骨架活动、膜受体功能的调节、转导有丝分裂信息以及促进细胞分泌等重要功能[2]。研究显示,前列腺癌、子宫颈鳞癌等多种肿瘤组织膜联蛋白A7的表达异常[3-4]。本研究旨在观察胃癌组织膜联蛋白A7表达的变化,初步探讨膜联蛋白A7与胃癌发生发展的关系。
1.1 标本来源 2011年6月至2012年12月,承德医学院附属医院胃癌手术切除标本55例、癌旁正常胃组织(与癌组织距离>5cm)25例,所有患者临床资料完整,术前均未进行放疗和化疗。55例胃癌患者,男31例、女24例;年龄28-85岁(中位年龄57岁),<60岁23例、>60岁32例;病理组织学分型:管状腺癌38例、粘液腺癌和印戒细胞癌17例;肿瘤分化程度:高、中分化20例,低分化35例;浸润深度:肿瘤未侵及浆膜30例,突破浆膜和侵及邻近结构25例。所取组织一部分10%中性甲醛固定、常规石蜡包埋、5μm连续切片,一部分入液氮保存。
1.2 主要试剂 膜联蛋白A7小鼠抗单克隆抗体,
Invitrogen公司;免疫组织化学试剂盒,北京四正柏生物科技有限公司;β-actin小鼠抗单克隆抗体,Santa Cruz公司。
1.3 膜联蛋白A7蛋白表达的检测
1.3.1 免疫组织化学染色:采用SP免疫组织化学染色法,一抗工作浓度1:150,以PBS替代一抗作为阴性对照。在显微镜(10×40倍)下观察拍照,每张切片上随机选5个视野,每个标本计数3张切片,采用MiVnt图像分析系统分析阳性产物面积与视野面积的比值,取平均值作为膜联蛋白A7的相对表达水平。
1.3.2 Western Blotting法:取100mg左右液氮保存组织,放入匀浆器中,加1ml细胞裂解液冰上匀浆,收集匀浆悬液,4℃,12000r/min离心15min,取上清,BCA法测蛋白浓度,加5×loading Buffer,95℃变性10min,50μg蛋白上样,进行SDS-PAGE电泳,PVDF膜转膜,5%脱脂奶粉封闭3h,膜联蛋白A7抗体(1:1000)4℃过夜,TBST洗膜3×10min/次,羊抗鼠二抗(1:3000)摇床上孵育1h,TBST洗膜3×5min/次,ECL发光,显影。FUJI Mini-4000扫描Western Blotting图像,应用Quantity One-4.6.2软件进行定量分析,以目的条带光密度与β-actin条带光密度的比值,作为膜联蛋白A7表达的相对水平。
1.4 统计分析 采用SPSS 16.0统计学软件处理数据,计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
膜联蛋白A7的表达:免疫组化染色结果显示,膜联蛋白A7免疫阳性产物位于胃腺上皮细胞胞浆,呈淡黄色或棕黄色。定量分析结果显示,胃癌组织膜联蛋白A7的表达水平明显高于癌旁正常胃组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。见附表。
附表 不同胃组织膜联蛋白A7的表达(±s)
附表 不同胃组织膜联蛋白A7的表达(±s)
免疫组化染色 Western Blotting胃癌 0.183±0.025 1.483±0.258癌旁正常组织 0.072±0.033 0.623±0.326 P <0.05 <0.05
膜联蛋白A7是Creutz等[5]首次从牛肾上腺髓质分离、纯化的一种能聚集嗜铬细胞颗粒的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,包括两个基本的功能结构域:一个高度可变的氨基末端结构域和一个高度保守的核心结构域。保守的核心结构域有Ca2+和磷脂的结合位点,有利于依赖钙离子促进膜的融合;氨基末端结构域则高度可变,与每一种膜联蛋白各自的特性有关[6]。
近年来,膜联蛋白A7与肿瘤发生发展关系的研究逐渐增多。Srivastava等[7]研究137例敲除膜联蛋白A7基因的小鼠发现,23%的突变体小鼠发生自发性肿瘤,表明膜联蛋白A7基因表达缺失参与了肿瘤的发展过程。此后,膜联蛋白A7与肿瘤相关的类似研究成果相继呈现。Srivastava等[3]发现,前列腺癌中膜联蛋白A7的表达显著降低;Hung等[8]发现,胶质母细胞瘤膜联蛋白A7的表达也显著下调。但也有学者的研究发现与上述结果不同,Srivastava研究膜联蛋白A7在乳腺癌中的表达时发现,乳腺癌膜联蛋白A7的表达明显上调;陈雪等[4]关于宫颈鳞癌的研究发现,从蛋白水平和mRNA水平膜联蛋白A7的表达都是升高的。李欣等[9]利用RNA干扰技术降低膜联蛋白A7在宫颈癌细胞系Hela细胞中的表达,发现Hela细胞的增殖速度明显减慢、凋亡增多,表明膜联蛋白A7可能具有促进Hela细胞增长的作用,提示膜联蛋白A7基因可能是一个促进肿瘤细胞生长的基因。
本研究分别采用免疫组织化学染色法、Western Blotting法研究发现,胃癌组织膜联蛋白A7的阳性表达率明显高于正常胃组织。结合其他学者的研究成果,推测膜联蛋白A7在胃癌的发生发展过程中可能具有促进作用,并提示膜联蛋白A7可能是一个新的参与胃癌发生发展的分子标志物,因此,本研究可为胃癌的临床诊断提供一个新的参考指标。但膜联蛋白A7在胃癌发生过程中具体的作用机制如何,有待进一步研究。
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[3]Srivastava M, Torosyan Y, Raffeld M.ANXA7 expression represents hormone-relevant tumor suppression in different cancers[J]. Int J Cancer, 2007, 121(12): 2628-2636.
[4]陈雪,高福禄,李欣,等.膜联蛋白A7在人宫颈鳞癌和正常组织中的表达[J].解剖学报,2010,41(4):603-605.
[5]Creutz CE, PazolesCJ, Pollard HB. Identi fi cation and puri fi cation of an adrenal medullary protein (synexin) that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaf fi n granules [J]. J Biol Chem, 1978, 253 (8): 2858-2866.
[6]Naidu DG, Raha A, Chen XL, et al. Partial truncation of the NH2-terminus affects physical characteristics and membrane binding aggregation, and fusion properties of annexin A7 [J]. Biochim Biophy Acta, 2005, 1734(2): 152-168.
[7]Srivastava M, Montagna C, Leighton X, et al. Haploinsuf fi ciency Of Anx7 tumor suppressor gene and consequentgenomic instability promotes tumorigenesis in the Anx7 (+/-) mouse[J] PNAS, 2003, 100(24): 14287-14292.
[8]Hung KS, Hong SL. Prognostic significance of annexin Ⅶexpression in glioblastoms multiforme in humans[J]. Neurosurg 2003, 99(5): 886-892.
[9]李欣,陈雪,王小杰,等.膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌HeLa细胞系增殖与凋亡的影响[J].解剖学报,2010(4): 572-575.
EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF ANNEXIN A7 IN GASTRIC CANCER
ZHANG Yang, XU Qian, CHEN Long, et al
(Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China)
Objective:To investigate the expression and significance of Annexin A7 in human gastric cancer.Methods:SP immunohistochemical staining and Western Blotting were respectively used to detect the expression of Annexin A7 in 55 cases gastric cancer and 25 cases para-carcinoma normal gastric tissue.Results:The Annexin A7 expression in gastric cancer was obviously higher than that in normal gastric tissue (P<0.05).Conclusions:Annexin A7 may participate in the development of gastric cancer.
Annnexin A7; Gastric cancer; Tumor
R735.2
A
1004-6879(2014)03-0193-03
2013-10-10)
△ 通讯作者