芝麻叶多酚的纯化及对蛋白质非酶糖基化的抑制作用

刘江辉，刘金盾，刘利娥，袁 军（.福建农林大学生命科学学院，福建福州5000；.郑州大学化工与能源学院，河南郑州45000；.郑州大学公共卫生学院，河南郑州45000）

芝麻叶多酚的纯化及对蛋白质非酶糖基化的抑制作用

刘江辉1，刘金盾2，刘利娥3，袁 军1
（1.福建农林大学生命科学学院，福建福州350002；2.郑州大学化工与能源学院，河南郑州450001；3.郑州大学公共卫生学院，河南郑州450001）

从D101、AB-8、NKA-9、S-8、ADS-5大孔吸附树脂中通过静态实验筛选出AB-8树脂，研究其对芝麻叶粗提物中多酚的静态吸附和解吸性能，并通过单因素实验确定AB-8树脂柱的最佳纯化工艺条件；然后，考察了芝麻叶多酚对体外蛋白质非酶糖基化终末产物（AGEs）生成的抑制作用。结果表明：AB-8大孔吸附树脂对芝麻叶多酚粗提物具有较好的分离纯化效果；AB-8树脂柱对芝麻叶多酚粗提物的最佳纯化条件为：上柱液体积12mL，上柱液浓度3.5mg/mL，pH5.0，洗脱体积为3BV（柱体积），依次以30%（v/v）和50%（v/v）乙醇溶液进行梯度洗脱，多酚纯度从16.88%分别提高到28.43%和45.71%，纯化产物分别命名为SPP1和SPP2。芝麻叶多酚粗提物、SPP1、SPP2对蛋白质非酶糖基化终产物的生成具有明显的抑制作用，抑制效果均优于阳性对照品氨基胍。

芝麻叶，多酚，纯化，蛋白质非酶糖基化终产物

芝麻属脂麻科，一年生草本植物，是我国最重要的油料作物之一。芝麻叶是芝麻生产的伴生物，产量大于芝麻的产量，资源极其丰富。芝麻叶中富含钾、钙、磷、铁等矿质元素、不饱和脂肪酸、氨基酸及多酚等，是一种口味鲜美的食品新资源[1]。植物多酚是植物体内重要的次生代谢产物，是一类分子结构中含多个酚羟基的化合物。植物多酚具有多种生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗菌和抗病毒、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、增强免疫以及美白和减肥等，受到了人们的普遍关注[2-3]。然而，采用有机溶剂法提取的多酚粗提物，常常含有一些糖类、果胶及蛋白质等杂质，这些杂质的存在对多酚的品质影响很大，既不利于保存，也不利于其成分分析和活性利用。因此，为提高芝麻叶提取物的利用价值，需要对粗提物进行纯化。大孔吸附树脂具有选择性好、吸附容量大、再生处理方便等诸多优点而广泛应用于天然产物的分离纯化[4-5]。因此，用大孔吸附树脂纯化芝麻叶粗提物对芝麻叶多酚的保存和利用具有重要意义。

蛋白质非酶糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）是指还原糖与蛋白质、脂质或核酸的氨基基团发生非酶促反应形成的一类复杂的不可逆聚合物[6]。现代医学研究证实，AGEs能改变蛋白质的结构和功能、影响脂质代谢、修饰核酸及诱导氧化应激，是糖尿病并发症发生的主要因素[7]。如AGEs在体内积蓄诱发动脉硬化、白内障、糖尿病性肾病以及心肺顺应性减低等[8-9]。这些糖尿病并发症是导致糖尿病患者致残、致死的主要原因。因此筛选开发抑制AGEs形成的食品或药物，对于预防和治疗糖尿病并发症有重要意义。迄今为止，关于芝麻叶抗AGEs形成的研究鲜有报道。本文对芝麻叶多酚粗提物的纯化工艺及其抗AGEs形成的抑制活性进行研究，为芝麻叶的深度开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芝麻叶 购于河南省驻马店平舆县；Folin-Ciocalteu试剂制备 参照文献[10]；盐酸氨基胍（Fluka Chemie Gmbh，Stenheim，Germany）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京鼎国生物技术有限责任公司；D-葡萄糖 Sigma-Aldrich公司；没食子酸、无水乙醇、盐酸、冰乙酸、氢氧化钠、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、硫代巴比妥酸等 均为分析纯，购自国药集团；D101、AB-8、NKA-9、S-8、ADS-5大孔吸附树脂 天津欧瑞生物科技有限公司。

UV-1601紫外可见分光光度计 日本岛津；RE2000旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；AY-120分析天平 日本岛津；TDL-4离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅 金坛市丹瑞电器厂；pHs-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；BT100蠕动泵 保定兰格恒流泵有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu法进行测定[11]，以没食子酸为标准品测定多酚的浓度。测定的标准曲线回归方程为：A=0.1103C+0.0095，R2=0.9981，C为多酚质量浓度（mg/L），A为吸光度。

1.2.2 样品液制备 芝麻叶→清洗→干燥→粉碎→过60目筛→脱脂（正己烷为溶剂，索氏提取法[12]）→70%（v/v）乙醇浸提（液料比50mL/g，微波功率420W，微波时间120s）→离心（4000r/min，20min）→上清液（旋转蒸发，浓缩，冷冻干燥）→芝麻叶多酚粗提物（Raw polyphenols）。

1.2.3 树脂纯化工艺 芝麻叶多酚粗提液→上大孔吸附树脂柱→水洗→乙醇梯度解吸→解吸液（旋转蒸发，冷冻干燥）→芝麻叶多酚纯化产物（SPP1，SPP2）。

1.2.4 树脂静态吸附与解吸实验 准确量取40.0mL一定浓度的芝麻叶多酚粗提物水溶液于100mL锥形瓶中，分别加入1g经处理的大孔吸附树脂（ADS-5、D101、AB-8、S-8、NKA-9）。在30℃恒温振荡器中以130r/min恒温振荡24h，取出锥形瓶，采用300目不锈钢滤网过滤，测定滤液中未被吸附的多酚浓度。将负载多酚的树脂转入100mL锥形瓶中，并用40.0mL 70%（v/v）乙醇少量多次冲洗滤网，保证所有树脂进入瓶内。于相同条件下解吸，取一定量解吸液测其多酚含量，并按下面的公式计算各种树脂的吸附量、吸附率及解吸率，以比较不同树脂对芝麻叶多酚的吸附和解吸特性。计算公式为：

q=Vo（Co-Ce）/m 式（1）

Ads（%）=（Co-Ce）/Co×100 式（2）

Des（%）=CdesVdes/（Co-Ce）Vo×100 式（3）

式中：Co—原料液中多酚浓度（mg/L）；Ce—吸附平衡时溶液中多酚浓度（mg/L）；Cdes—洗脱液中多酚浓度（mg/L）；Vo—原料液体积（mL）；Vdes—洗脱液体积（mL）；q—单位树脂吸附多酚的饱和吸附量（mg/g）；Ads—多酚吸附率（%）；Des—多酚解吸率（%）。

1.2.5 动态吸附与解吸实验

1.2.5.1 上样液体积的影响 将50.0mL筛选出的大孔树脂采用湿法装柱，装入内径为1.5cm、柱长40.0cm的层析柱中，纯水洗涤平衡后上样。初始上样液浓度为2.0mg/mL，用恒流泵以1.0mL/min的流速进样，上样液体积分别为4、8、12、16、20mL，吸附平衡2h。吸附平衡后，用1BV（柱体积）的水淋洗树脂柱，再用3BV 70%（v/v）乙醇洗脱，洗脱流速2.0mL/min。收集洗脱液，测定芝麻叶多酚的浓度，计算多酚的回收率。

1.2.5.2 上样液pH的影响 上样条件：最佳上样液体积由1.2.5.1确定，上柱液pH分别为2、3、4、5、6、7。测定洗脱液多酚浓度，计算多酚回收率。

1.2.5.3 上样液浓度的影响 上样条件：最佳上样液体积由1.2.5.1确定，最佳上柱液pH由1.2.5.2确定，上柱液浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL。测定洗脱液多酚浓度，计算多酚回收率。

1.2.5.4 洗脱液乙醇体积分数的影响 上样条件：最佳上样液体积由1.2.5.1确定，最佳上柱液pH由1.2.5.2确定，上柱液浓度由1.2.5.3确定，洗脱液乙醇浓度分别为10%、30%、50%、70%、95%（v/v）。测定洗脱液多酚浓度，计算多酚回收率。多酚回收率计算公式：

式中：Cdes、C0分别为洗脱液和原料液中多酚浓度（mg/mL）；Vdes、V0分别为洗脱液和原料液进样体积（mL）；R为多酚回收率（%）。

1.2.5.5 洗脱曲线 按上述所确定的最佳条件上样和洗脱，每10.0mL收集一份洗脱液，测定洗脱液中多酚浓度，以洗脱液体积为横坐标（mL），洗脱液中多酚浓度（mg/L）为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定洗脱终点。

1.2.6 芝麻叶多酚的纯化 在1.5cm×40.0cm吸附柱优化出实验条件的基础上，使用容量更大的柱子（4.0cm×60.0cm）进行实验。考察依次用纯水、30%、50%、70%、95%（v/v）乙醇为洗脱剂时，用等强度洗脱和梯度洗脱的方式得到纯化部位中多酚的纯度。多酚纯度计算公式：

式中：X为纯化部位中多酚的质量分数（%）；m为洗脱物的质量（mg）；Vdes为洗脱液体积（mL）；Cdes为洗脱液中多酚浓度（mg/mL）。

取500mL AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱（4.0cm× 60.0cm），自然沉降12h。用1BV水冲洗柱子。准确称取3.0g芝麻叶多酚粗提物，用适量纯水溶解，蠕动泵以1.0mL/min流速把样品溶液加到柱子顶端，平衡4h。流动相以3.0mL/min的流速，用1BV水洗，依次用3BV 30%、50%、70%、95%（v/v）乙醇洗脱，分别收集洗脱液。将洗脱液旋转蒸发，浓缩至浸膏，冷冻干燥，分别得到不同体积分数的乙醇洗脱物。按照同样的方法，分别用30%、50%、70%、95%（v/v）乙醇为洗脱剂进行等强度洗脱，洗脱液的处理方法同梯度洗脱，分别得到不同乙醇体积分数的等强度洗脱物。

1.2.8 蛋白质非酶糖基化实验 采用牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glu）反应体系模型[13]，实验分组见表1。用新煮沸又冷却的纯水分别配制25.0、75.0、150mg/L的氨基胍和芝麻叶多酚溶液，并配制pH7.4的磷酸盐缓冲液，用缓冲液配制20.0mg/L的牛血清白蛋白（用0.22μm滤膜除菌）、0.5mol/L葡萄糖溶液；按表1所示将相应溶液加入到50mL无菌培养瓶中，反应瓶置于55℃培养箱，孵育42h。孵育到设定时间时，取0.3mL糖基化反应溶液，稀释至3.0mL，测定AGEs在激发波长370nm、发射波长440nm处的荧光强度F。根据模型组、样品组、样品空白组的荧光强度计算芝麻叶多酚对BSA非酶糖基化的抑制率（Inhibition rate，IR）。

式中：Fblank为空白组，Fmodel为模型组，Fsample为样品组，IR为抑制率（%）。

表1 体外BSA非酶糖基化实验分组Table 1 List spot of protein non-enzyme glycation assay method in vitro

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂纯化芝麻叶多酚实验结果

树脂静态吸附与解吸性能比较 表2列出了五种大孔树脂对芝麻叶多酚的静态吸附和解吸性能。由表2可知，非极性的D101型和弱极性的AB-8型大孔树脂的富集效果较好。这可能是芝麻叶多酚结构中含有部分酚羟基而具有一定的极性，在吸附过程中容易形成氢键吸附；同时在解吸过程中，氢键吸附极易被强极性的低碳醇类洗脱剂破坏，所以洗脱也相对容易，解吸率也较高。综合评价其对芝麻叶多酚的吸附与解吸性能，确定AB-8型大孔树脂作为分离纯化芝麻叶多酚的最佳树脂。

2.2 大孔树脂动态吸附与解吸实验

2.2.1 原料液体积的影响 原料液进样体积对多酚回收率的影响，结果见图1。由图1显示，进样液体积较低时，多酚回收率随进样体积的增加而增大，当进样液体积由4.0mL增加到12.0mL时，多酚回收率由39.25%增加到87.44%；随后多酚回收率随进样体积增加缓慢下降。这是由于进样液体积增加，导致穿透点提前，多酚回收率下降。因此，原料液进样体积控制在12.0mL左右较合适。

图1 上样液体积对树脂吸附性能的影响Fig.1 Effect of sample volume on polyphenols recovery rate

表2 大孔树脂的结构性能参数及静态吸附-解吸结果Table 2 Physical characters of macroporous resins and results of static adsorption and desorption

2.2.2 原料液pH的影响 在原料液体积为12.0mL时，考察原料液pH的影响，结果如图2所示，在pH为4.0、5.0、6.0时，多酚回收率分别为86.19%、94.72%和87.12%。这是由于多酚类化合物的结构中具有多羟基酚结构或糖苷键，故呈弱酸性，因此在弱酸性条件下能达到较好的吸附效果，由此得出，进样液pH控制在5.0较为合适。由于芝麻叶多酚粗提液的pH在5.0附近，所以，实验均用芝麻叶多酚粗提液直接上样。

图2 上样液pH对树脂吸附性能的影响Fig.2 Effect of sample pH on polyphenols recovery rate

2.2.3 原料液浓度的影响 原料液浓度对大孔吸附树脂纯化多酚的回收率的影响见图3。由图3所示，当多酚粗提物浓度较低时，多酚回收率随多酚浓度的增加而增大，当上样液浓度达到3.5mg/mL时，多酚回收率达到最大91.71%；随后多酚回收率随着多酚浓度上升而下降。这是由于原料液浓度过高，导致穿透点提前，多酚回收率下降。因此，选择上样溶液浓度为3.5mg/mL。

图3 上样液浓度对树脂吸附性能的影响Fig.3 Effect of sample concentration on polyphenol recovery rate

2.2.4 洗脱剂乙醇浓度的影响 在原料液体积为12mL，浓度为3.5mg/mL的条件下，考察乙醇体积分数对多酚回收率的影响，结果如图4所示，乙醇体积分数由10%增大到50%（v/v）时，多酚回收率由24.04%增大到91.71%；继续增大乙醇体积分数，多酚回收率开始缓慢下降，因此选择50%乙醇作为最佳洗脱剂。

2.2.5 解吸曲线分析 以50%（v/v）乙醇为洗脱剂，洗脱曲线见图5。

图5显示，大孔树脂上吸附的多酚类物质随着洗脱剂的不断洗脱，逐渐流出分离柱。当洗脱体积为50～80mL时，洗脱液中的芝麻叶多酚浓度较高。继续用洗脱液洗脱，洗脱液中多酚浓度降低，当洗脱液体积为150mL时，150mL处洗脱液中多酚浓度已经趋于零，而所用大孔树脂柱体积为50.0mL，因此用3BV（柱体积）的洗脱剂可将多酚类物质完全洗脱。

图4 乙醇体积分数对树脂洗脱效果的影响Fig.4 Effect of volume ratios of ethanol on polyphenols recovery rate

图5 洗脱曲线Fig.5 Elution curve of sesame leaf polyphenols on AB-8 macroporous resin

2.2.5 大孔树脂纯化前后芝麻叶多酚纯度的测定 芝麻叶多酚粗提物、等强度洗脱物、梯度洗脱物中多酚含量的测定结果见表3。从表3看出，等强度洗脱中，50%、70%、95%（v/v）乙醇洗脱物中多酚含量接近，高于30%（v/v）乙醇洗脱物中多酚含量；但是在梯度洗脱中，芝麻叶多酚纯度可由原来的16.88%±3.22%提高到45.71%±5.34%（p＜0.01）。在梯度洗脱中，30%、50%（v/v）乙醇洗脱物分别标记为SPP1、SPP2。结果显示AB-8大孔树脂对芝麻叶多酚初步纯化的效果良好。

表3 芝麻叶多酚粗提物及纯化部位中多酚纯度Table 3 The contents of polyphenols in raw polyphenols and purified polyphenols from sesame leaf

2.3 芝麻叶多酚对牛血清白蛋白非酶糖基化的影响

2.3.1 牛血清白蛋白（BSA）非酶糖基化进程的荧光光谱 BSA经过非酶糖化反应最后形成的AGEs显棕色，具有高度荧光性和交联性。BSA非酶糖基化进程的荧光光谱见图6。

图6 牛血清白蛋白（BSA）非酶糖基化进程的荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectrums of BSA non-enzyme glycation products at reaction proceeding

从图6可知，非酶糖基化反应6h时的荧光光谱中峰位置在420nm。随着反应的进行，到12～24h时，光谱图在420～445nm范围内呈现平台样；反应进行到30～42h时，光谱图的峰位置长移到440nm。光谱形状的改变是由荧光分子内部结构的改变引起的，而荧光强度的变化（峰值高低）则是由荧光物质含量的高低决定的。非酶条件下，牛血清白蛋白在高浓度葡萄糖环境中逐渐糖化生成了糖化蛋白即AGEs，同时，随着牛血清白蛋白糖基化反应的进行，AGEs的浓度逐渐增加。

2.3.2 芝麻叶多酚对体外AGEs生成的抑制作用 芝麻叶多酚对体外AGEs生成的影响见图7。

图7 芝麻叶多酚对体外AGEs生成的影响Fig.7 Inhibitions of sesame leaf polyphenols and AG on the formation of AGEs in vitro

图7 显示，与阳性对照AG相比，芝麻叶多酚粗提物、SPP1、SPP2对AGEs生成均有明显的抑制效应，剂量增加，抑制效率增加，其抑制能力由强到弱的顺序为：SPP1≈多酚粗提物＞SPP2＞氨基胍。

3 结论

3.1 考察了五种不同大孔树脂对多酚粗提物的静态吸附及解吸效果，优选出纯化效果最好的AB-8大孔吸附树脂，得到的最佳条件为：进样量12.0mL，原料液浓度3.5mg·mL-1，进样液pH5.0。采用3BV的50%（v/v）乙醇溶液洗脱，所得多酚纯度可从16.88%提高到33.84%；若采用3BV的30%、50%（v/v）乙醇溶液进行梯度洗脱，纯化产物分别命名为SPP1和SPP2，其多酚纯度可分别达到28.43%和45.71%。

3.2 芝麻叶多酚粗提物、SPP1、SPP2对AGEs的生成具有明显的抑制作用，抑制作用与其浓度之间存在剂量-效应关系，抑制效果均优于阳性对照品氨基胍。因此，芝麻叶多酚能延缓蛋白质非酶糖基化进程因而具有潜在的预防或治疗糖尿病的作用。对芝麻叶的深度开发利用能极大地提高这一农副产品的附加值，既符合食品研究发展方向，又与绿色经济模式相一致。

[1]刘利娥，宋少华，刘金盾.芝麻叶营养成分分析[J].食品科技，2012，37（2）：45-47，51.

[2]Daglia M.Polyphenols as antimicrobial agents[J].Current Opinion in Biotechnology，2012，23（2）：174-181.

[3]Boulekbache-Makhlouf L，Slimani S，Madani K.Total phenolic content，antioxidant and antibacterial activities of fruits of＜i＞Eucalyptus globulus＜/i＞cultivated in Algeria[J].Industrial Crops and Products，2013，41：85-89.

[4]张立华，张元湖，安春艳，等.石榴皮提取物的大孔树脂纯化及其抗氧化性能[J].农业工程学报，2009，25（1）：142-147.

[5]王吉昌，王振宇，文攀，等.半制备液相-高效液相色谱技术测定红松树皮中多酚物质的研究[J].食品工业科技，2012，33（2）：73-76.

[6]Yamagishi S，Maeda S，Matsui T，et al.Role of advanced glycation end products（AGEs）and oxidative stress in vascular complications in diabetes[J].Biochimicaet Biophysica Acta（BBA）-General Subjects，2012，1820（5）：663-671.

[7]彭善丽，张根义.茶多酚对蛋白质糖基化作用的影响[J].食品工业科技，2011，32（12）：45.

[8]Thomas M C，Söderlund J，Lehto M，et al.Soluble receptor for AGE（RAGE）is a novel independent predictor of all-cause and cardiovascular mortality in type 1 diabetes[J].Diabetologia，2011，54（10）：2669-2677.

[9]Dina R，Vladu I，Dina C，et al.Advanced Glycation End Products Measured by Age Reader in a Group of Patients with Obesity[J].Romanian Journal of Diabetes Nutrition and Metabolic Diseases，2012，19（1）：59-66.

[10]Slinkard K，Singleton V L.Total phenol analysis：automation and comparison with manual methods[J].American Journal of Enology and Viticulture，1977，28（1）：49-55.

[11]郭娟，艾志录，崔建涛，等.苹果渣中多酚物质的福林法测定[J].食品工业科技，2006，27（2）：178-180.

[12]高蓉.化香树果序活性成分提取、分离、应用及动力学研究[D].西安：西北大学，2009.

[13]Dugé de Bernonville T，Guyot S，Paulin J P，et al. Dihydrochalcones：Implication in resistance to oxidative stress and bioactivities against advanced glycation end-products and vasoconstriction[J].Phytochemistry，2010，71（4）：443-452.

Purification and non-enzymatic glycation inhibitory activities of polyphenols from sesame leaf

LIU Jiang-hui1，LIU Jin-dun2，LIU Li-e3，YUAN Jun1
（1.School of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2.School of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.School of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Five kinds of macroporous adsorbent resins including D101，AB-8，NKA-9，S-8，ADS-5 and AB-8 resin were selected as a suitable material for the purification of sesame leaf polyphenols by static research，respectively.One factor-at-a-time method was used to determine the optimal operating conditions for purification of the polyphenols from sesame leaf.Then，the protein glycation inhibitory activity of polyphenols aqueous from sesame leaf was evaluated in vitro using the model system of bovine serum albumin and glucose.The results indicated that AB-8 macroporous resin has better adsorption and desorption ability to purify the raw polyphenols.The optimum conditions were as follows：sample solution 12.0mL，raw polyphenols concentration 3.5mg/mL，pH5.0.If the gradient elution was applied using 30%and 50%（v/v）ethanol for 3BV，purification products were named SPP1 and SPP2，the polyphenol contents were 28.43%（SPP1）and 45.71%（SPP2），respectively，while in crude samples the yield was 16.88%.As to advanced glycation end products（AGEs）formation inhibition activities，the raw polyphenol，SPP1 and SPP2 showed strong inhibitory effect on the development of non-enzymatic glycation reaction，much stronger than that of the positive control（Aminoguanidine），which suggests potential anti-diabetic properties.

sesame leaf；polyphenols；purification；advanced glycation end products

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.016

2013－09－10

刘江辉（1986-），男，硕士研究生，研究方向：天然产物生物活性研究。

河南省教育厅科技攻关项目（13A330682）；福建农林大学青年教师科研基金重点项目：（ky0140040）。