合欢皮提取物对黑曲霉抑菌活性的研究

白羡钦，代光辉，陈 佳，陈义娟，庞倩茹，郭 松（上海交通大学农业与生物院，上海200240）

合欢皮提取物对黑曲霉抑菌活性的研究

白羡钦，代光辉*，陈 佳，陈义娟，庞倩茹，郭 松
（上海交通大学农业与生物院，上海200240）

采用滤纸片法和生长速率法，测定了合欢皮乙醇提取物对4种常见菌种的抑菌活性；结果表明：合欢皮乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度（MIC）为20mg/mL，对黑曲霉的抑制中浓度（EC50）为12.43mg/mL，即对黑曲霉抑菌效果较好。再进一步采用生长速率法，测定了合欢皮4种萃取物对黑曲霉（Aspergillus niger）的抑菌活性。4种萃取物中，正丁醇相对黑曲霉抑菌效果最好，其EC50为7.68mg/mL。结论：合欢皮乙醇提取物对黑曲霉的有效抑菌成分主要集中于正丁醇相，对于开发天然食品防腐剂有很大价值与潜力。

合欢皮，乙醇提取物，抑菌活性，黑曲霉

由微生物引起的食品腐败问题十分严重，而且有的微生物是对人体有害的致病菌，有的则会产生对人体有害的毒素。例如，大肠杆菌易导致人体泌尿道感染和腹泻；金黄色葡萄球菌不仅是导致人体化脓感染最常见的病菌[1]，还会分泌引起人类胃肠炎性等疾病的葡萄球菌肠毒素[2]；黑曲霉会产生损伤人体皮肤进而致癌的黄曲霉素、B1或单端孢菌毒素[3]，因此选用安全、有效的防腐剂是食品生产及贮藏的重要任务。

目前使用最广泛的是化学合成防腐剂，主要有苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）及亚硝酸盐类等，但其仍存在着一定的安全隐患。而来源于植物、动物和微生物的天然防腐剂因其具有安全无毒等优点，引起了人们的极大重视[4]。近年来，关于天然植物源防腐剂的研究逐渐增多，大多是从植物提取抑菌成分用于防腐。例如，顾仁勇等研究，由9%牛至精油、9%丁香精油、9%山苍子精油及9%肉桂精油组成的复合保鲜剂可有效延长冷藏猪肉保鲜期[5]。何首林等研究，八角茴香油对富士苹果有显著的防腐作用；肉桂醛、丹参提取物等对番茄有显著的防腐作用[6]。

合欢（Albizia julibrissin Durazz.）的干燥树皮合欢皮是一种传统中药，其不仅化学成分复杂，还具有活血消肿、解郁安神、抗生育及增强免疫的医疗功效[7-8]。有多项研究发现，合欢皮中含有的多种三萜皂苷对癌细胞的抑制作用较好[9-10]。但目前国内外针对合欢皮抑菌活性的报道较少，主要是针对合欢叶、合欢花或合欢荚果的抑菌活性的研究[11-15]。该研究主要测定了合欢皮提取物对4种菌的抑菌活性，并在此基础上主要对黑曲霉的抑菌活性进行了研究，以期为开发新的天然植物源防腐剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

合欢皮 购于毫州市贡药饮片厂，现存放于上海交通大学植物健康与天然产物实验室，将购买后的合欢皮粉碎、冷藏备用；金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.a）、大肠杆菌（Escherichia coli，E.c）、白色念珠菌（Canidia albicans，C.a）、黑曲霉（Aspergillus niger，A.n） 由上海交通大学植物健康与天然产物实验室提供；牛肉膏蛋白胨培养基 蒸馏水1000mL、牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂15g，pH7.0～7.2；马铃薯葡萄糖琼脂培养基 蒸馏水1000mL、马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g；NaOH、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等 均为分析纯；Phenonip 瑞士Clariant公司。

RE-52AA型旋转蒸发器、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 上海比朗仪器有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SA-960-Ⅱ型SHJ系列洁净工作台 上海汇龙仪表电子有限责任公司；SPX-100B-D型恒温振荡培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DL-180超声波 浙江省象山县石浦海天电子仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 合欢皮乙醇提取物的制备 分别称取1000g植物粉末，用10L 70%的乙醇密闭浸泡提取3次（5、2.5、2.5L），每次24h。每次浸泡后，抽滤1次，合并，得到合欢皮乙醇提取物。待圆底烧瓶晾至常温、干燥，称量，减去干净空瓶在室温、干燥时的重量，则是提取物的重量。3次抽滤得到的滤液，在45℃、-0.1MPa的条件下用旋转蒸发器减压浓缩至溶剂蒸干。加入一定体积的蒸馏水，超声波振荡溶解，配制成一定浓度的溶液，冷藏备用。

1.2.2 合欢皮溶剂萃取物的制备 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取合欢皮乙醇提取物的蒸馏水溶液5次，得到4种萃取物，分别在45℃、-0.1MPa的条件下用旋转蒸发器减压浓缩至溶剂蒸干，称量，减去干净空瓶在室温、干燥时的重量，则是各萃取物的重量。加入一定体积的蒸馏水，超声波振荡溶解，配制成一定浓度的溶液。

1.2.3 菌悬液的制备 用牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养真菌。分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌接种于培养基斜面上，37℃培养20～22h活化，再将活化后的菌体转入装有9mL无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，分别稀释成10-2～10-6CFU/mL的菌悬液。

1.2.4 抑菌活性的测定 采用滤纸片法[16]测定不同浓度的合欢皮乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌活性。先将直径为6mm的灭菌滤纸片在不同浓度的合欢皮乙醇提取物的蒸馏水溶液中浸泡2h。在培养基平板上分别均匀涂布金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的菌悬液各0.2mL。将浸泡后的滤纸片等距置于平板上，每个菌种设4个重复。设无菌水为阴性对照，质量分数为0.5%的Phenonip为阳性对照。37℃培养3d后，用十字交叉法测量并记录抑菌圈直径。

采用生长速率法[17-18]测定合欢皮乙醇提取物、各溶剂萃取物对黑曲霉的菌丝生长抑制率。含药培养基的制备：将不同浓度的合欢皮提取液与培养基各按1∶4的比例混匀，倒入培养皿，配制成不同浓度的含药培养基，待培养基冷却后将直径为9mm的黑曲霉菌饼置于平板中央。设不含提取液的培养基为阴性对照，含质量分数为0.5%Phenonip的培养基为阳性对照。37℃培养3d后，用十字交叉法测量并记录菌落直径，根据以下公式计算菌丝生长抑制率。

式中：D1为对照组菌落直径（mm）；D2为处理组菌落直径（mm）。

1.3 数据处理方法

采用Duncan’s法对数据进行方差分析。并进行回归分析，计算抑制中浓度（EC50）。

表1 合欢皮70%乙醇提取物对4种菌种的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of the 70%ethanolic extract of A.julibrissin Durazz.bark concents against four microoganisms

2 结果与分析

2.1 合欢皮乙醇提取物对4种菌的抑菌活性

由表1可知，在2.5～80mg/mL的浓度范围内，合欢皮70%乙醇提取物对大肠杆菌、白色念珠菌无抑制作用，对金黄色葡萄球菌和黑曲霉则均有与浓度成正相关的抑菌效果，但对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较弱，其最低抑制浓度（MIC）为20mg/mL。而合欢皮70%乙醇提取物对黑曲霉的抑菌效果则比较明显。在20～80mg/mL的浓度范围内，合欢皮70%乙醇提取物对黑曲霉的抑菌率虽然低于阳性对照的抑菌率，但均达到52%以上。

表2 相同浓度合欢皮萃取物对黑曲霉的菌丝生长抑菌率（%）Table 2 Inhibition rates of four phases of A.julibrissin Durazz.bark extract with the same concentration against A.niger mycelial growth（%）

据金玉兰等研究发现合欢叶乙醇提取物对苹果腐烂病菌（Valsa mali）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）4种真菌均有一定抑菌活性[11]。贾福丽等也发现合欢茎叶乙醇提取物对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、终极腐霉病菌（Pythium ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3种真菌也有一定抑制活性[14]。这些报道均说明合欢植物中存在一定的抗菌物质。而本实验表明合欢皮乙醇提取物只对金黄色葡萄球菌和黑曲霉有抑制作用，对其他2种菌无效，说明合欢皮中的抗菌物质不是广谱的，且对不同菌种的抑菌效果可能会有差异。

2.2 合欢皮乙醇提取物对黑曲霉菌丝生长抑制的EC50

通过拟合曲线，得到合欢皮70%乙醇提取物对黑曲霉菌丝生长抑制作用的毒力回归方程为Y= 36.7630+5.2522Ln（X），相关系数为0.9862，由此求得合欢皮乙醇提取物对黑曲霉的EC50为12.43mg/mL。

2.3 合欢皮萃取物对黑曲霉菌丝生长的抑菌活性

由表2可知，当天数相同时，抑菌率最高的均是阳性对照，最低的均是阴性对照，且20mg/mL的四种萃取物按抑菌率由高到低依次排序：正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相、水相，其中正丁醇相的抑菌率显著高于石油醚相和乙酸乙酯相，只有水相无抑菌作用。在菌丝生长3～6d后，3种有效萃取物的抑菌率均随时间增长而降低，但正丁醇相的抑菌率下降得比石油醚相和乙酸乙酯相慢。虽然20mg/mL正丁醇的抑菌率显著低于阳性对照，但其仍可在菌丝生长6d后保持较高抑菌率，达74.84%，说明正丁醇相对黑曲霉菌丝生长的抑制效果具有持久性。由此结果可以看出合欢皮乙醇提取液中对黑曲霉的抑菌活性物质主要存在于正丁醇相中，属于极性比较大的物质；而由石油醚相、乙酸乙酯相萃取出来的极性比较小的物质活性比较弱或者活性不持久。

金玉兰等发现合欢叶乙醇提取物对苹果腐烂病菌（V.mali）、番茄灰霉病菌（B.cinerea）、立枯丝核病菌（R.solani）和辣椒炭疽菌（C.capsici）4种真菌的抑菌活性物质主要存在于正丁醇相中[11]。贾福丽等也发现合欢茎叶乙醇提取物对棉花枯萎病菌（F. oxysporum f.sp.vasinfectum）、终极腐霉病菌（P. ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3种真菌的抑制活性物质也主要存在于正丁醇相中，而不是石油醚相、乙酸乙酯相或水相中[14]。由此可以推测，合欢植物乙醇提取物的正丁醇相中可能含有一定的抗真菌的活性物质，故对于合欢皮乙醇提取物正丁醇相的研究是有意义的。

2.4 合欢皮正丁醇相对黑曲霉菌丝生长的抑菌活性

表3 合欢皮正丁醇相对黑曲霉的菌丝生长抑菌率Table 3 Inhibition rates of the n-butanol phase of A.julibrissin Durazz.bark extract against A.niger mycelial growth

由表3可知，在0.3125～40mg/mL的浓度范围内，合欢皮正丁醇相对黑曲霉有抑菌效果，且抑菌率均随正丁醇相浓度增大而增大。40mg/mL正丁醇相对黑曲霉的菌丝生长抑菌率高达100.00%，与阳性对照相同，由此说明高浓度下的正丁醇相可以高效抑制黑曲霉的菌丝生长。0.3125、0.625、1.25mg/mL正丁醇相的抑菌率之间无显著差异，当由1.25mg/mL增加到2.5mg/mL时，抑菌率显著提高。2.5、5、10、20、40mg/mL正丁醇相的抑菌率之间两两差异显著。

通过拟合曲线，得出合欢皮正丁醇相对黑曲霉菌丝生长抑制作用的毒力回归方程为Y=12.3510+ 4.9039X，相关系数为0.9907，由此求得合欢皮正丁醇相对黑曲霉的EC50为7.68mg/mL。而金玉兰等发现合欢叶正丁醇相对苹果腐烂病菌（V.mali）、番茄灰霉病菌（B.cinerea）、立枯丝核病菌（R.solani）和辣椒炭疽菌（C.capsici）4种真菌的EC50在0.012～0.920mg/mL内[11]。贾福丽等也发现合欢茎叶正丁醇相对棉花枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.vasinfectum）、终极腐霉病菌（P.ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3种真菌的EC50在0.8841～1.8958mg/mL内[14]。可以看出合欢叶或合欢茎叶对以上植物病原真菌的EC50均低于该实验中合欢皮正丁醇相对黑曲霉的EC50，由此考虑到合欢茎叶对黑曲霉的抑菌效果是否也会高于合欢皮对黑曲霉的抑菌效果，还有待进一步研究的。

综合以上结果，可以看出合欢皮提取物的正丁醇萃取相对黑曲霉的抑菌效果明显，甚至与阳性对照效果相同，考虑到合欢皮中天然化学成分很多[8]，从该有效相中进一步分离和纯化活性结构，对于进一步开发植物源天然防腐剂具有一定的意义，将在实验室下一步工作中进行。

3 结论

通过测定合欢皮70%乙醇提取物对4种供试菌种的抑菌活性，发现合欢皮乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉均有抑菌作用，但对黑曲霉的抑菌效果较明显。通过对黑曲霉抑菌效果的进一步研究发现合欢皮乙醇提取物的石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相中均含有对黑曲霉有抑菌作用的活性成分，而水相则对黑曲霉无效；其中正丁醇相对黑曲霉的抑菌效果更持久。且正丁醇相在高浓度时对黑曲霉抑菌作用很明显：20mg/mL的浓度达到85.32%的抑菌率；40mg/mL的浓度则达到100.00%的抑菌率，与阳性对照Phenonip的抑菌效果相同。该研究结果为进一步开发植物源天然防腐剂奠定了一定的基础。

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Study on the antimicrobial activity of Albizia julibrissin Durazz.bark extract against Aspergillus niger

BAI Xian-qin，DAI Guang-hui*，CHEN Jia，CHEN Yi-juan，PANG Qian-ru，GUO Song
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

The antimicrobial activities of the ethanolic extract of A.julibrissin Durazz.bark against four common microorganisms were evaluated using paper disc method and mycelial growth inhibition method.The results showed that the ethanolic extract had a minimal inhibitory concentration（MIC）of 20mg/mL against Staphylococcus aureus and a median effective concentration（EC50）of 12.43mg/mL against Aspergillus niger.These results indicated that the antimicrobial activity of the ethanolic extract against A.niger was higher than that against three other microorganisms.Then the four phases of the extract were tested against A.niger using mycelial growth inhibition method.The n-butanol phase was the most effective against A.niger among the four phases and its EC50was 7.68mg/mL.In conclusion，the bioactive constituents were mainly in the n-butanol phase and these results provided people with great value and potential in tapping natural food preservatives.

Albizia julibrissin Durazz.bark；ethanolic extract；antimicrobial activity；Aspergillus niger

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.019

2013－10－14 *通讯联系人

白羡钦（1989-），女，硕士研究生，研究方向：植物源防腐剂。