哈茨木霉产水解热凝胶的内切β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化

徐　敏，李　晶，郑志永，朱　莉，詹晓北，，*，李　珊，张洪涛（1.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏无锡214125）

哈茨木霉产水解热凝胶的内切β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化

徐敏1，2，李晶1，2，郑志永1，2，朱莉3，詹晓北1，2，3，*，李珊1，2，张洪涛1，2
（1.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏无锡214125）

结合多种分离方法，从哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371）的发酵产物中分离得到一种对不溶性多糖热凝胶具有较高水解活性的内切β-1，3-葡聚糖酶。结果表明，哈茨木霉发酵液经50%饱和度硫酸铵沉淀预处理后，依次经过HiPrep 26/10 desalting层析柱脱盐、QFF阴离子交换层析柱去除杂质蛋白，最终经Superdex 75凝胶柱纯化获得纯度较高的内切β-1，3-葡聚糖酶。最终酶活回收率为6.63%，内切酶比酶活由6.86U/mg提高到133.01U/mg，纯化倍数达到19.39倍。MALDI-TOF-TOF鉴定结果表明，该内切酶与产自绿色木霉的endoglucanase存在较高的同源性。

哈茨木霉，β-1，3-葡聚糖内切酶，热凝胶，分离纯化

β-1，3-葡聚寡糖作为一类重要的生理活性物质，其应用范围逐渐扩大[1-2]。例如β-1，3-葡聚寡糖可以通过刺激宿主免疫功能、激活巨噬细胞、中性粒细胞和天然杀伤细胞而具有抗菌抗肿瘤活性[3-6]。目前水解具有β-1，3-糖苷键的葡多糖是制备β-1，3-葡聚寡糖的主要方法。而以专一性内切酶降解多糖制备相应寡糖具有水解条件温和、操作简便、高效等优点，是当前研究和应用的热点。内切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.6或EC3.2.1.39）能够沿分子链随机切割β-1，3-糖苷键，释放出小分子量寡糖（DP 2-10）。同时该类酶来源广泛，植物、真菌以及细菌中均有发现。因此，通过内切β-1，3-葡聚糖酶降解β-1，3-葡聚糖获取相应寡糖是一种较为理想的方法。除此之外，β-1，3-葡聚糖酶在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料工业和发酵工业生产方面也有着巨大的潜在应用[7]。

热凝胶是一种由土壤杆菌（Agrobacterium sp.）合成的线性无支链胞外β-1，3-葡聚糖，被广泛应用于食品、化妆品等领域。因而热凝胶可以作为安全的生产β-1，3-葡聚寡糖的原料。研究表明，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）发酵产物中存在多种β-1，3-葡聚糖酶[8-12]，但能够利用热凝胶作为水解底物的内切β-1，3-葡聚糖酶鲜有报道[13]。

本研究选取以热凝胶为主要碳源的哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）发酵液，依次经过硫酸铵沉淀预处理、分子筛层析除杂质、阴离子交换层析初步分离以及分子筛层析纯化等操作，获得了纯度较高的具有显著水解热凝胶活性的内切β-1，3-葡聚糖酶。本研究可以为热凝胶处理及内切β-1，3-葡聚糖酶纯化等工业放大问题提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）菌种由江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室保藏；种子培养基（g/L） 葡萄糖15，酵母粉20，硫酸铵2.5，磷酸二氢钾6，硫酸镁0.8，氯化钙1，pH6.0；发酵培养基（g/L） 热凝胶25，葡萄糖5，硝酸钠9，胰蛋白胨1，磷酸二氢钾20，七水硫酸镁0.3，氯化钙0.4，pH6.0；热凝胶（Curdlan） 购于Takeda-Kirin Food Co.（日本）；其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司（上海）。

Silica gel 60 F254层析板购自Merck KGaA，（德国）；CS-9301PC双波长飞点扫描薄层分析仪Shimadzu Corp.，日本；JYSCZ2+凝胶电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司；阴离子交换层析与体积排阻层析系统均采用ÄKTA AvantGE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典；层析柱为HiPrep 26/10 Desalting、HiTrap Q FF、Superdex 75 10/300 GL瑞典。

1.2实验方法

1.2.1蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G250染色法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白绘制标准曲线。

1.2.2内切酶酶活的测定取一定量的酶液加入到0.5mL 10g/L的热凝胶底物（25mmol/L pH6.0磷酸盐缓冲液配制）中，酶与底物质量比为1∶200，用缓冲液补足体积，使得终反应体积为1mL，50℃反应3h，沸水浴煮沸10min终止反应。寡糖含量（DP2-5）可由TLC薄层层析法[14]结合双波长飞点扫描仪进行半定量检测，精确定量根据HPLC利用Click Maltose柱分析寡糖含量。

将每小时催化水解热凝胶后获得1mg寡糖（DP2-5）所需酶的量定义为一个内切酶酶活单位（U）。

1.2.3粗酶液的制备将哈茨木霉菌株以5%（v/v）接种量接种于发酵培养基，于25℃，105r/min振荡培养6d。发酵结束后，首先经8层纱布过滤发酵液得到滤液，然后滤液于8000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。然后于-20℃冷冻保存备用。

1.2.4硫酸铵沉淀粗分离蛋白缓慢加入一定量硫酸铵至设定饱和度，然后用稀H2SO4或氨水调节pH至设定值，并于4℃静置过夜使蛋白充分沉淀，然后处理液于4℃，8000×g离心15min。最后以去离子水复溶沉淀至一定浓度溶液，并于-20℃冷冻保存备用。

1.2.5内切β-1，3-葡聚糖酶的纯化

1.2.5.1脱盐柱层析取浓缩的粗酶液，以水作为流动相，流速2.5mL/min，进样量为20mL，经HiPrep 26/10 desalting层析柱脱盐，除去小分子杂质。

1.2.5.2阴离子交换层析采用ÄKTA Avant蛋白纯化系统对脱盐处理后的上述酶液进行AEC分离。先以20mmol/L pH8.0的PBS缓冲液平衡层析住，流速为1mL/min。然后进样1mL，进样后先平衡两个柱体积，再以1mol/L NaCl溶液进行等度洗脱，收集每个峰测定酶活，将有酶活力的组分进行冻干浓缩。

1.2.5.3体积排阻层析AEC洗脱得到的活性组分0.5mL上样于G75凝胶过滤层析柱，洗脱液为含0.1mol/L NaCl的20mmol/L pH7.0的PBS缓冲液，流速为0.5mL/min，每1mL收集测定酶活，收集有酶活的组分，进行超滤脱盐，冻干浓缩。

1.2.6蛋白质SDS-PAGE分析及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定使用不连续垂直电泳系统，对分离纯化的β-1，3-葡聚糖内切酶进行分析。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳采用pH8.3的Tris-HCl缓冲体系。电泳后考马斯亮兰R250进行染色分析。将纯化出的单一蛋白条带进行切胶，MALDI-TOF-TOF鉴定。

2　结果与分析

2.1硫酸铵沉淀预处理哈茨木霉发酵液

2.1.1pH和温度对硫酸铵沉淀效果的影响随着温度改变，一定饱和度的硫酸铵溶液中硫酸铵质量分数会随之改变，且发酵液中蛋白质在不同pH条件下的电荷状态存在差异，为此，首先考察了pH和温度对硫酸铵沉淀效果的影响。

表1　pH对硫酸铵沉淀蛋白效果的影响Table 1　Effect of pH on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

表2　温度对硫酸铵沉淀蛋白效果的影响Table 2　Effect of temperature on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

选择20%饱和度的硫酸铵溶液，在pH5.3～8.3，4～25℃范围内，将哈茨木霉发酵液经硫酸铵沉淀后，对蛋白回收率、回收蛋白β-葡聚糖酶活力、水解产物中寡糖含量、寡糖占总糖比例等指标进行了测定。结果见表1和表2，在上述pH和温度范围内，各项测定指标间均无显著差异。说明在较温和条件下（pH5.3～ 8.3，4～25℃），硫酸铵沉淀提取目标蛋白（内切β-1，3-葡聚糖酶）不受pH和温度影响。

2.1.2硫酸铵饱和度对获取目标蛋白的影响哈茨木霉发酵液经不同饱和度硫酸铵溶液沉淀后结果差异明显（图1）。由图1可知，当硫酸铵饱和度为30%时，回收后蛋白表现出较高的内切β-1，3-葡聚糖酶活性，热凝胶水解液中寡糖浓度（DP 2-5）达到1.3g/L，在总糖中所占比例达到最高，为74%。当硫酸铵饱和度提高至40%时，水解液中寡糖含量明显降低，而单糖所占比例增加到几乎50%。随着硫酸铵饱和度的进一步升高，热凝胶水解液中总糖浓度逐渐下降，可能原因是杂质蛋白在较高硫酸铵饱和度时逐渐析出，降低了目标蛋白在蛋白沉淀中所占的比例（图2，蛋白回收率随着硫酸铵饱和度提高显著增加）。由此可见，低硫酸铵饱和度有利于内切β-1，3-葡聚糖酶活性的富集。

图1　不同硫酸铵饱和度沉淀蛋白水解热凝胶得到的寡糖分析Fig.1　Results of degrading curdlan to oligosaccharide by different ammonium sulfate saturation on protein extraction

图2　不同硫酸铵饱和度沉淀所得到的蛋白酶活分析Fig.2　Influence of ammonium sulfate saturation on enzyme activity

尽管降低硫酸铵饱和度对目标蛋白提取有利，但是蛋白回收率和总酶活回收率均明显偏低（图2）。综合考虑总酶活回收率、比酶活提高倍数、大规模生产的操作成本等几方面因素，选择硫酸铵饱和度为50%较为适宜。在此条件下，总酶活回收率达到63.42%，内切酶比酶活比发酵液提高33%。

2.2阴离子交换与分子筛层析结合纯化内切β-1，3-葡聚糖酶

2.2.1杂质组分的初步去除哈茨木霉发酵液经硫酸铵沉淀处理后，复溶样品中含有的无机盐及多肽等杂质会对后续分离产生干扰，因此首先采用分子筛层析方法对复溶蛋白样品进行初步纯化。选择HiPrep 26/10 desalting色谱柱（MWCO=5000u），以去离子水为洗脱剂，流速2.50mL/min时的样品洗脱曲线见图3。测定结果表明，在该分离条件下，蛋白组分（图3，P1）与杂质分子实现了较好的分离，P1组分可用于后续纯化操作。

图3　HiPrep 26/10 desalting脱盐柱脱盐曲线Fig.3　Chromatography of protein by HiPrep 26/10 desalting

2.2.2内切β-1，3-葡聚糖酶的纯化随后，采用离子交换层析方法对除去杂质的蛋白组分（图3，P1）进一步纯化，条件优化后发现，在pH8.0时，采用阴离子交换层析柱对目标蛋白实现了较好的分离。图4为采用HiTrap Q FF阴离子交换层析柱获得的洗脱曲线，按峰收集组分。经酶活测定发现，水解热凝胶活性集中在P1区域（穿透峰），P2区域（吸附蛋白峰）未检测到水解活性。表明目标蛋白未与层析填料产生吸附作用，此时穿透峰与吸附蛋白峰明显分离，且无机盐浓度较低，有利于后续操作进行，同时，较为简便的阶段洗脱方法更利于实现工业化放大。

图4　HiTrap Q FF阴离子交换洗脱曲线Fig.4　Chromatography of protein by HiTrap Q FF

然后，采用分子筛层析方法对目标蛋白峰（图4，P1）进一步纯化。选择Superdex 75 10/300 GL色谱柱，经条件优化后得到了较为理想的分离效果（图5，图6）。经蛋白浓度测定，洗脱后蛋白集中在峰1～4（图5），其余均为非蛋白峰。然后，采用薄层层析法（TLC）对峰1～4水解热凝胶产物进行了分析。结果表明，峰2（11～13mL）表现出外切酶活性，峰4（15～ 17mL）表现出了明显的内切β-1，3-葡聚糖酶活性（图6，Lane 3）。由于内切酶是随机切割β-1，3糖苷键，因此水解得到的并不都是寡糖，有少量的单糖。

图5　Superdex 75 10/300 GL凝胶柱洗脱曲线Fig.5　Chromatography of protein by Superdex 75 10/300 GL

图6　不同纯化阶段蛋白样品水解热凝胶产物的TLC鉴定图谱Fig.6　TLC analysis of curdlan hydrolyzates by protein samples at different purification steps

图7　内切β-1，3-葡聚糖酶纯化过程SDS-PAGE图谱Fig.7　SDS-PAGE results of proteins during the purification of endo-β-1,3-glucanase

图7为内切β-1，3-葡聚糖酶分离各步骤的SDSPAGE电泳图谱。由图7可知，经过硫酸铵沉淀预处理、分子筛层析除杂质、阴离子交换层析初步分离以及分子筛层析纯化等一系列操作后，最终获得了单一条带的内切β-1，3-葡聚糖酶产品（MW=73.6ku）。最终蛋白回收率为6.63%，比酶活达到133.01U/mg，纯化19.39倍（表3）。为获得电泳纯度较高的蛋白，分子筛层析只收集了峰4的峰尖2mL，因此最终酶活回收率偏低。

2.2.3纯化后内切β-1，3-葡聚糖酶的鉴定为进一步考察纯化后内切β-1，3-葡聚糖酶的性质，采用MALDI-TOF-TOF二级质谱对纯化后蛋白序列进行了分析。通过与NCBI non-redundant protein sequences中的已知蛋白序列进行比对，发现与产自绿色木霉（Trichoderma virens）中的endoglucanase（GenBank no. ABO93399.2）存在较高的同源性，匹配分值为181分。该蛋白分子量81ku，等电点6.4，均与本研究纯化得到的内切β-1，3-葡聚糖酶接近。

图8　纯化后内切β-1，3-葡聚糖酶与endoglucanase（GenBank no.ABO93399.2）序列比对结果Fig.8　Sequence alignment between the purified endo-β-1，3-glucanase and endoglucanase（from Trichoderma virens，GenBank no.ABO93399.2）

3　结论

本研究建立了从哈茨木霉（T.harzianum Rifai ACCC30371）发酵液中获取可以降解热凝胶的内切β-1，3-葡聚糖酶的纯化方法，并且结合定量薄层层析法以水解液中寡糖浓度代替总糖浓度用以评价内切酶活性。结果表明，发酵液经过硫酸铵沉淀预处理、分子筛层析除杂质、阴离子交换层析初步分离以及分子筛层析纯化等操作后，最终获得了纯度较高的内切β-1，3-葡聚糖酶。经测定，内切酶分子量73.6ku，最终纯化19.39倍。该蛋白与产自绿色木霉（Trichoderma virens）的endoglucanase蛋白具有较高的同源性。

表3　内切β-1，3-葡聚糖酶纯化数据汇总Table 3　Summary of purification of the endo-β-1，3-glucanase from T.harzianum Rifai ACCC30371

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Purification of an endo-β-1，3-glucanase to degrade curdlan from Trichoderma harzianum

XU Min1，2，LI Jing1，2，ZHENG Zhi-yong1，2，ZHU Li3，ZHAN Xiao-bei1，2，3，*，LI Shan1，2，ZHANG Hong-tao1，2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

In combination with a variety of purification methods，an endo-β-1，3-glucanase was separated from Trichoderma harzianum fermentation broth，which had high hydrolysis activity to insoluble polysaccharide curdlan.The purification process was carried out sequentially as follows，50%ammonium sulfate precipitation from cell culture supernate，HiPrep 26/10 desalting gel chromatography，removing impurities protein by QFF anion exchange column，finally was purified by Superdex 75 gel chromatography.The enzyme activity yield was 6.63%.The purification scheme resulted in an increase in the specific activity（from 6.86 to 133.01U/mg）and a 19.39-fold purification of endo-β-1，3-glucanase relative to the crude broth.Identified by MALDITOF-TOF，the result showed that the purified enzyme had high homology with the endoglucanase from Trichoderma virens.

Trichoderma harzianum；endo-β-1，3-glucanase；curdlan；purification

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.025

2013－11－07*通讯联系人

徐敏（1988-），女，硕士研究生，研究方向：蛋白纯化与功能性寡糖制备。

国家自然科学基金（31171640，31201384，31271888）；无锡市科技支撑计划（农业）（CLE01N1208）；无锡市生物农业领军型创业人才计划（“130”计划）。