昌黎赤霞珠葡萄相关酿酒酵母的分离与筛选

蒋文鸿，严 斌，陶永胜（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌71100；.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

昌黎赤霞珠葡萄相关酿酒酵母的分离与筛选

蒋文鸿1，2，严 斌2，陶永胜1，*
（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌712100；2.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

以昌黎地区赤霞珠葡萄为样本，从中分离出5种酵母。通过菌落特征、菌体形态及赖氨酸培养基鉴定，初步确定其中4株为葡萄酒酿酒酵母。通过高浓度酒精（10%～18%）、高浓度SO2（100～400mg/L），高糖浓度（10%～60%）和高温（37、42℃）的耐受性实验，初步筛选出两株可耐受14%浓度酒精、300mg/L SO2、50%的葡萄糖浓度及42℃高温的菌株。与市售的两种酿酒酵母进行葡萄酒发酵实验，将所得酒样进行理化分析及感官品评，结果表明菌株a发酵力强，较市售酵母菌发酵后挥发酸含量低，残还原糖含量为0.40g/L，且葡萄酒感官评价最高。最终选出菌株a为赤霞珠葡萄酿酒酵母最佳菌株。

昌黎，葡萄酒，酿酒酵母，菌株筛选，发酵

葡萄酒是一种营养丰富的低酒精度发酵饮料，是新鲜葡萄或葡萄汁的发酵产品，具有很高的保健功能[1]。葡萄酒的发酵过程是一个复杂的微生物参与的生物化学变化过程，酵母菌是发酵过程的主导微生物[2]。酿酒酵母的发酵特性因菌株不同而存在明显差异[3]，对底物的利用和生成的物质也不同，从而使发酵产物的风味物质存在差异，赋予产品独特的风味[4-5]。

目前我国在葡萄酒酵母的研究和利用方面发展还远不如生产方面的发展迅速，葡萄酒生产所用菌种大部分依赖进口，造成在品种和风格上比较单一，地域特色不突出[6-8]。

昌黎是中国葡萄栽培的重要区域，也是酿酒葡萄原料和葡萄酒的主要生产基地之一。可能存在与地方优质名牌葡萄酒的品种形成相关的天然优良酵母菌株[9]。基于此，通过耐受性实验及葡萄酒发酵实验，对昌黎地区赤霞珠葡萄皮上的天然酵母进行了筛选，从中筛选出适合本土特色葡萄酒酿造的优良的酵母菌株。本研究对葡萄酒产区酵母种质资源的探明以及筛选优良的本地酵母菌株具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昌黎赤霞珠葡萄 中粮华夏长城葡萄酒有限公司提供；丹宝利高效活性葡萄酒酿酒干酵母 广西丹宝利酵母有限公司；VR5酿酒酵母 法国Laffort（拉氟德）；柠檬酸、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚硫酸、盐酸、斐林试剂A、斐林试剂B、次甲基蓝、葡萄糖、酚酞 均为分析纯。

GZX-9240 MBE型数显鼓风干燥机、SPX-250BZ型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HC014-11-018-01（X）型立式压力蒸汽灭菌器筒 上海云泰仪器有限公司；AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；BCD-649WADV型电冰箱 青岛海尔股份有限公司；BA80-C型生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；L1V型mini紫外可见分光光度计 日本日立。

1.2 培养基配方

YPD琼脂培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，琼脂2%，pH自然，121℃灭菌20min。液体YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH自然，121℃灭菌20min。

WL营养培养基：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，储液A 40mL/1000mL，储液B 1mL/1000mL，调pH至6.0～6.5，再加入琼脂2%，灭菌后冷却至50～ -60℃，加储液C 1mL/1000mL，混匀后倒平板。

储液A：磷酸二氢钾5.5g，氯化钾4.25g，氯化钙1.25g，硫酸镁1.25g，定容至400mL，121℃灭菌20min后4℃保存。使用时按40mL/1000mL加入。

储液B：氯化铁0.25g，硫酸锰0.25g，定容至100mL，121℃灭菌20min后4℃保存。使用时按1mL/1000mL加入。

储液C：0.44g溴甲酚绿溶于10mL无菌水和10mL 95%酒精中，配制储液C的所有器具都必须灭菌。配制好的C液不需要灭菌，使用时按1mL/1000mL加入。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，121℃灭菌20min。

LM培养基（赖氨酸培养基）：购自英国Oxoid公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母的富集培养及分离 剔除腐烂、发霉、破损的果粒及杂物，称取均匀完整葡萄果粒6.0g，加入100mL无菌的YPD液体培养基中，振摇，置于28℃生化培养箱培养48h。在无菌室内将富集液用无菌生理盐水以10倍梯度稀释至10-7，分别涂布于WL营养琼脂培养基平板上进行分离纯化。生化培养箱中28℃倒置培养5d后观察，记录菌落颜色和形态，将具有酵母形态的菌株转接并经多次划线纯化，获得纯化菌株[10]。纯化菌株保藏于试管斜面中，备用。

1.3.2 杜氏管发酵实验 麦芽汁发酵法：将活化传代的酵母菌接入带有杜氏管的麦芽汁（10Brix）培养基中，25℃培养48h，初筛出产气好的酵母菌株，接种量为1.0×107cfu/mL。用显微镜观察其活细胞形态，筛选出酵母菌。

1.3.3 赖氨酸培养基鉴定 酿酒酵母不能利用赖氨酸作为氮源，因而在赖氨酸培养基上不能生长。将经过纯化和镜检的酵母菌接种于YPD液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种到5mL无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸平板培养基，并置于27℃培养5d后观察是否有菌落生长，培养48h后没有菌落出现的继续培养，直到15d后仍无菌落生长可确定是酿酒酵母。

1.3.4 筛选菌株的耐受性实验

1.3.4.1 高浓度酒精的耐受性实验 将灭菌后的YPD琼脂培养基降温至40℃左右，在无菌操作室内按10%、12%、14%、16%、18%（v/v）加入乙醇，分别接种新鲜培养的酵母菌单菌落在YPD固体平板进行生长实验，生化培养箱中28℃倒置培养，7d后以生长状况表征其酒精和SO2耐受性。

1.3.4.2 SO2耐受性实验 将灭菌后的YPD琼脂培养基降温至40℃左右，在无菌操作室内按100、200、250、300、350、400mg/L的浓度加入SO2，分别接种新鲜培养的酵母菌单菌落在YPD固体平板进行生长实验，生化培养箱中28℃倒置培养，7d后以生长状况表征其SO2耐受性。

1.3.4.3 高温耐受性实验 移取15mL融化的YPD琼脂培养基于10支试管中，倾斜放置，待培养基凝固，分别接种新鲜培养的酵母菌单菌落，各取5支置于37、42℃生化培养箱中，培养7d后以生长状况表征其高温耐受性。

1.3.4.4 糖浓度耐受实验 在无菌室用移液管分别移取15mL糖浓度为10%、20%、30%、40%、50%和60%（m/v）的YPD琼脂培养基于试管中，待培养基凝固，分别接种新鲜培养的酵母菌单菌落。置于生化培养箱28℃进行生长实验，以生长状况表征其对不同浓度糖的耐受性。培养7d后观察生长情况[8]。

1.3.5 葡萄酒发酵实验 将筛选得到的酵母菌a、d与市售的两种酵母菌丹宝利高效活性干酵母、VR5酿酒酵母同时进行葡萄酒发酵实验：a菌种发酵一号罐，d菌种发酵二号罐，丹宝利高效活性干酵母发酵三号罐，VR5酵母发酵四号罐。筛选出的酵母经菌落计数后换算成固态接种量，经计算与市售酵母添加量相同，均为0.2g/kg，每组设3个平行，结果取平均值。每天压帽后观察葡萄酒颜色变化、记录香气差异和口味的变化，每天每罐测两次比重、温度，发酵温度控制在20～25℃[11-13]。

1.3.6 酵母发酵葡萄酒感官评价 用比重计测量葡萄酒比重，数值在0.993～0.996时发酵结束。分离皮渣并对皮渣进行压榨。将葡萄酒转移到用亚硫酸溶液清洗过的瓶子中排尽空气，下胶储存。下胶完全后，从色泽、香气、香味三个方面对葡萄酒进行感官评价[14-15]。

评价小组选择食品学院教师和学生共40人，对其进行词汇的介绍与演示、描述标度的介绍、初步实践、较小差异的训练和最后实践等培训，最后选择20名参加实验人员为实验的品评员。每种酒样用高脚杯呈送，并用3位随机数字编号，同答题纸一并随机呈送给评价小组。品评员在单独的品评室内品尝葡萄酒，对每种样品的各种感官指标进行打分。实验重复2次进行[16]。葡萄酒感官鉴评标准见表1。

1.3.7 酵母发酵葡萄酒理化指标测定 葡萄酒酒度的测定采用密度瓶法法定；葡萄酒总糖及残糖的测定采用斐林试剂法；葡萄酒挥发酸的测定采用蒸馏滴定法；总酸的测定采用氢氧化钠滴定法；SO2测定采用直接碘量法；干浸出物测定采用密度瓶法；色度测定采用分光光度法；单宁测定采用分光光度法；总酚测定采用分光光度法[17-19]。

表1 葡萄酒感官鉴评标准Table 1 The assessment standards of sensory evaluation for wine

2 结果与分析

2.1 酵母的富集培养及分离

从昌黎赤霞珠酿酒葡萄产区不同地块收集葡萄果粒80份，每份100g，收集于灭菌袋中0～4℃保存。经过富集培养和划线分离，镜检共分离得到酵母238株。

2.2 杜氏管发酵实验

对分离得到的238株酵母菌进行杜氏管产气实验，结果显示，在48h内充满气体的有61株。进一步进行菌株验证实验。

2.3 显微镜镜检

酵母菌是单细胞真核微生物，形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等，比细菌的单细胞个体要大得多[17]。菌株a、c、e的形态均为卵圆形，菌株b形态为球形，d为椭圆形，是酵母菌的常规形态，表明五株菌株均为酵母菌，见图1。活菌镜检所分离的菌株初步确定五种不同的菌株，分别命名为a、b、c、d、e。

图1 五株菌株的细胞形态Fig.1 Cell morphology of five species strains

2.4 赖氨酸培养基鉴定

将酵母菌菌株接种到赖氨酸培养基后，观察其生长情况。表2是赖氨酸培养基鉴定实验各菌株生长状况。

可以看出不能利用赖氨酸作为氮源生长的菌株有a、b、c、d，而菌株e在饥饿处理后在赖氨酸培养基上能够正常生长，证明其能够利用赖氨酸作为氮源生长。故确定菌株a、b、c、d是酿酒酵母。

表2 赖氨酸培养基鉴定实验结果Table 2 Results of lysine experimental test

2.5 优良酵母的耐性

对a、b、c、d 4株菌株进行高酒精浓度（10%～18%）、高浓度SO2（100～400mg/L），高糖浓度（10%～60%）和高温（37℃和42℃）的耐受性实验，结果见表3～表6。

由表3可知c菌株可耐受10%～12%的酒精，该浓度范围内大量生长，14%以上的酒精浓度环境下不生长；b、d菌株均可耐受10%～14%的酒精，其中d菌株较b菌株先出现菌落，d大量生长，b只有微量生长；a菌株可耐受10%～18%的酒精，18%酒精浓度下微量生长。4菌株中a菌株的酒精耐受性最强，较山东、甘肃等地区筛选出的耐受16%酒精浓度的酵母耐受性高[17]。

表3 受试菌株对高浓度酒精耐受性测试结果Table 3 Results of tolerance test for strains by high concentration alcohol

由表4可知在100mg/L的SO2中四种菌株均大量生长，且均不耐受400mg/L的SO2。菌株a最高可耐受350mg/L的SO2，与其他地区筛选实验所得酵母菌的最高耐受性水平持平[10，17]；b、d菌株最高可耐受300mg/L的SO2；c菌株最高可耐受250mg/L的SO2。

由表5得出四种菌株都可在10%～50%浓度的葡萄糖中生长，状态良好。60%浓度葡萄糖环境下都不生长，与目前酿酒酵母葡萄糖耐受性强度相当[18]。

由表6得出在37℃条件下四种菌株都可生长，其中a菌株生长状态最好，其次为为b、d菌株。42℃条件下只有a、d两菌株可生长；b、c不生长。

结合各耐性实验结果得出a、d两菌株对高酒精浓度、高SO2浓度、高浓度葡萄糖和高温的耐受性最好。与庞红勋等[8]从天津地区产的葡萄中分离筛选出耐受14%酒精浓度，350mg/L SO2浓度，50%葡萄糖浓度和42℃高温的优良酿酒酵母耐受性相当。因此最终选择采用菌株a和d进行发酵实验。

表4 受试菌株对高浓度SO2耐受性测试结果Table 4 Results of tolerance test for strains by high concentration SO2

表5 受试菌株对高糖浓度耐受性测试结果Table 5 Results of tolerance test for strains by high concentration sugar

表6 受试菌株对高温耐受性测试结果Table 6 Results of tolerance test for strains by high temperature

2.6 发酵实验

用a、d两种酵母菌进行葡萄酒发酵实验，另接种丹宝利高效活性酿酒干酵母和VR5活性干酵母进行对比实验。发酵过程中葡萄酒比重的变化如表7所示。菌株的发酵理化实验结果见表8。葡萄酒的感官鉴评结果见表9。

表7 各发酵罐中葡萄酒的比重变化Table 7 Changes of the proportion of wines in the fermentation tank

从表7中可知，一号发酵罐中a酵母菌发酵的葡萄酒在前四天的比重变化为0.021，较对应二号0.009大，表示a菌株发酵速度比d快，发酵力强。两种菌对应发酵罐中葡萄酒的比重变化均与市售酿酒酵母发酵的葡萄酒比重变化相差不大。a菌株酵母菌发酵力较d菌株发酵力强，与市售酵母相当。

优良葡萄酒酵母应具有生长速率快、耐高糖、耐SO2、发酵平稳、酒精产率高、发酵完全等特性（本土葡萄酒）[9]。由表8可知，在发酵实验中，菌株a和d的酒精产率较高，分别为7.8%和8.0%；还原糖残留量低，分别为0.40、0.50g/L，其中a菌株发酵葡萄酒残还原糖含量低于d菌株，说明a比d发酵完全，菌株a对葡萄的发酵性能比菌株d高；葡萄酒的总糖含量为2.6g/L，低于市售酵母菌，更易于保存，说明a，d两菌株的发酵性能较好。葡萄酒干浸出物含量两株菌均高于市售酵母菌，且a菌株高于d菌株，都显著高于国标中的18g/L；a、d菌株总酚含量高于市售菌株，其中菌株d最高为0.95mg/L，而总酚是影响葡萄酒的保健功能的主要成分[1，20]。另外，乙醇、挥发酸、总糖均在国家标准内。

感官评定结果见表9，市售酵母菌发酵的葡萄酒的色、香、味各项指标均良好，酒香浓郁、酒质醇厚，而筛选出的2株酵母菌发酵后的香气纯正、香味浓郁，酒质醇厚，符合国家标准（GB 15037-2006）。菌株d发酵所得的葡萄酒色泽纯正，透亮，香气馥郁，但口感略差。菌株a发酵所得的葡萄酒色泽呈红宝石色，口感浓郁幽香，香气尤为突出，且风味独特。菌株a比菌株d发酵彻底，残还原糖含量低，发酵迅速，葡萄酒风味更佳，是所筛选菌株中优良的菌株，可作为后续的实验菌株。

表8 发酵理化实验结果Table 8 Results of physical and chemical test in fermentation

表9 葡萄酒的感官鉴评结果Table 9 Results of sensory evaluation for wines

3 结论

从昌黎地区特色酿酒葡萄中筛选出4株酵母，进行了菌落形态和细胞形态分离鉴定，其中菌株a和菌株d对酒精、SO2、糖、高温的耐受性较b、c株菌株强。发酵性能结果表明菌株a的发酵力较菌株d强，发酵速度更快，且a菌株发酵所得葡萄酒的葡萄香气尤为突出，风味独特，颇受鉴评者喜爱。菌株a是本研究所获得的优良菌株，可采用基因工程对其进行进一步改良，以期最终能应用于昌黎地区特色葡萄酒的生产。

[1]鲍建民．葡萄酒的营养成分及保健功能[J]．食品与药品，2006，8（3）：72-74.

[2]Domizio P，Romani C，Lencioni L，et al.Outlining a future for non-Saccharomyces yeasts：selection of putative spoilage wine strains to be used in association withSaccharomyces cerevisiaefor grape juice fermentation[J]．International Journal of Food Microbiology，2011，147（3）：170-180.

[3]Vernocchi P，Ndagijimana M，Serrazanetti D I，et al.Use ofSaccharomyces cerevisiaestrains endowed with beta-glucosidase activity for the production of Sangiovese wine[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology，2011，27（6）：1423-1430.

[4]华子安，田亚平，金其荣.选育耐高温酒精酵母的研究[J].酿酒，2003，30（3）：37-41.

[5]陶永胜，李华，王华，等．葡萄酒中主要的黄酮类化合物及其分析方法[J].中外葡萄与葡萄酒，2001（4）：21-22.

[6]Lee PR，Saputra A，Yu.B，et al.Effects of pure and mixedcultures ofSaccharomyces cerevisiaeand Williopsis saturnus on the volatile profiles of grape wine[J].Food Biotechnology，2012，26（4）：307-325.

[7]薛军侠．酿酒酵母的筛选鉴定及耐受性初步研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.

[8]苏艳秋，朱卫华，吴鹏，等.耐高温、耐酸产酒精酵母的筛选与鉴定[J].微生物学杂志，2009，29（3）：43-47.

[9]庞红勋，崔艳，刘金福，等.本土葡萄酒酵母的选育及发酵性能[J].食品研究与开发，2010，31（6）：169-173.

[10]王慧，张立强，刘天明，等.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定[J].酿酒科技，2007，15（9）：29-34.

[11]Capece A，Romaniello R，Siesto G，et al.Selection of indigenousSaccharomyces cerevisiaestrains for Nero d’Avola wine and evaluation of selected starter implantation in pilot fermentation[J].International Journal of Food Microbiology，2010，144（1）：187-192.

[12]王英，周剑忠，朱佳娜，等.蓝莓自然发酵酒中优良酵母菌的筛选及鉴定[J].中国食品学报，2013，13（4）：202-206.

[13]Soden A，Francis I L，Oakey H，et al.Effects ofco-fermentation with Candida stellata andSaccharomyces cerevisiaeon the aroma and composition of Chardonnaywine[J].Australian Journal of Grape and Wine Research，2000，6（1）：21-30.

[14]Settanni L，Sannino C，Francesca N，et al.Yeast ecology of vineyards within Marsala wine area（western Sicily）in two consecutive vintages and selection of autochthonousSaccharomyces cerevisiaestrains[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，114（6）：606-614.

[15]张晓煜，亢艳丽，袁海燕，等．酿酒葡萄品质评价及其对气候条件的响应[J]．生态学报，2007，27（2）：740-745.

[16]李志江，牛广财，李兴革，等.定量描述分析（QDA）在葡萄酒感官评定中的应用研究[J].中国酿造，2009，6：158-160.

[17]徐艳文.甘肃地区葡萄酒相关酵母菌的分离及其分类鉴定[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.

[18]刘庆军，刘天明，张京涛，等.新疆野生酵母发酵特性研究[J].山东轻工业学院学报：自然科学版，2009，23（4）：33-36.

[19]侯曼玲.食品分析[M]．北京：化学工业出版社，2005.

[20]Suzzi G，Arfelli G，Schirone M，et al.Effect of grape indigenous Saccharomyces cerevisiae strains on Montepulciano d’Abruzzo red wine quality[J].Food Research International，2012，46（1）：22-29.

Isolation and screening of Sacchamyces cerorevisiae from grape harvested in Changli

JIANG Wen-hong1，2，YAN Bin2，TAO Yong-sheng1，*
（1.College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.COFCO，Huaxia Greatwall wine Co.，Ltd.，Changli 066600，China）

Five species of yeast were isolated from Cabernet Sauvignon grapes cultivated in Changli County，and four were identified as Saccharomyces cerevisiae based on colony characteristics，cell morphology and Lysine Medium.Two Saccharomyces cerevisiae strains which could tolerate 14%alcohol concentration，concentration of 300mg/L SO2，glucose concentration 50%and 42℃ high temperature were selected via tolerance test.Compared with two Saccharomyces cerevisiae strains commercially available based on sensory evaluation and Physico-chemical analysis，selected strain“a”had the best fermentation most power，and the wine had the best taste with lowest volatile acids and 0.4g/L reducing sugar.So the selected strain“a”was the best Saccharomyces cerevisiae strain for Cabernet Sauvignon fermentation.

Changli；wine；Saccharomyces cerevisiae；strain screening；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.035

2014－01－03 *通讯联系人

蒋文鸿（1980-），男，硕士研究生，工程师，主要从事葡萄酒酿造方面的研究。

国家十二五科技支撑计划（2012BAD31B07）：优质果酒加工关键技术研究及产业化示范项目。