即食海蜇中特定腐败菌的分离及PCR检测

娄永江，柳 丽（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

即食海蜇中特定腐败菌的分离及PCR检测

娄永江，柳 丽
（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

利用传统的微生物检测方法及PCR技术快速检测即食海蜇中的优势腐败菌，检测结果显示：PCR检测与传统方法鉴定出的结果一致，即食海蜇的特定腐败菌为芽孢杆菌、假单胞菌以及腐败希瓦氏菌。

PCR技术，即食海蜇，特定腐败菌

即食海蜇是一种低脂肪、高蛋白的食品，深受广大消费者的喜爱，因此也成为众多学者研究的一个方向[1-5]。由于这种海产品含水量高、营养好，容易发生腐败变质，而微生物则是引发产品腐败变质的主要原因。因此，探索导致即食海蜇变质的微生物种类，才能有效地对产品的品质进行监控，这也是提高即食海蜇产品质量的前提。因微生物种类繁多，国外学者通过对水产品中腐败微生物进行的长期研究，提出来特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）[6]的概念。

一直以来，微生物的鉴定都是采取传统的方式：通过培养基对菌种进行分离纯化培养，之后从形态学、生理生化反应特征等进行菌种鉴定[7]，这个过程费时费力，而且结果的准确性受到了诸多因素的影响[8]。近年来随着分子技术的发展，利用分子生物学技术来解决微生物分类鉴定变得简单易行，现在比较常见的是利用PCR技术快速鉴定菌种。PCR技术[9-10]即是聚合酶链反应（polymerase chain reaction），于20世纪90年代美国学者研究提出，此技术已被广大学者运用研究。目前，国内外还暂未发现有人将PCR技术运用到即食海蜇的研究上。本实验主要利用传统方法及PCR技术检测即食海蜇中的特定腐败菌，为研究即食海蜇制品的贮藏保鲜提供基础。

1 材料与方法

即食海蜇 宁波市天峰水产有限公司；平板计数琼脂（PAC）培养基 青岛海博生物公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、10×PCR Buffer、dNTP、DNA聚合酶Taq、MgCl2、超纯水、引物27F、1492R等 上海捷瑞生物工程有限公司。

TY10TC-512型PCR扩增仪 英国TECHNE；MP2000D型电子天平 上海实验仪器总厂；BCD-256H型冰箱 海尔集团；W-CJ-IB型净化工作台 苏州净化设备厂；HH-4型数显恒温水浴锅 上海实验仪器厂；150A型生化培养箱 江苏环宇科学仪器厂；DYY-6C型稳流稳压电泳仪 南京惠普生物公司；Champgel 6000型凝胶成像仪 美国BIO公司；YM100Z型立式压力蒸汽灭菌锅 上海三申有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离纯化实验 在无菌条件下，取贮存期为200d、已明显腐败的即食海蜇制品，称取即食海蜇及溶液100g，用无菌研钵捣碎后准确称取25g，加入到225mL的无菌蛋白胨溶液（内含10g的无菌玻璃珠），充分振荡15min后取1mL上清液，进行1∶10梯度实验稀释。选取10-5浓度的溶液，分别放置在培养基上进行微生物涂布培养。根据生食水产品常含细菌的种类，挑选合适的培养基，充分培养出即食海蜇中含有的细菌种类，所挑选培养基如下：

表1 几种常见水产品菌的选择培养基及培养条件Table 1 Culture media and culture conditions of several common aquatic bacteria

利用不同的选择培养基对即食海蜇所含菌进行培养，挑选相应菌种的典型生长菌落，在平板培养基上反复进行划线分离培养，直至得到纯化的单菌落。之后利用伯杰氏系统细菌学手册[11]，对于得到的单个菌落进行菌落特征和菌体形态的鉴定。

1.2.2 细菌的生理生化实验测定 依据细菌的一般常用鉴定方法[12]，对所得的菌落进行过氧化氢酶实验、氧化酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、精氨酸双水解酶实验、V-P（乙酰甲基甲醇）实验、MR（甲基红）实验。

1.2.3 即食海蜇细菌DNA的提取 利用QIAGEN公司提取基因组DNA试剂盒直接提取DAN。

1.2.4 PCR扩增 在PCR扩增中，选用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以1.2.3中提取的基因组DNA为模板，选择50μL反应体系进行PCR扩增。

3.选择一个合适的地方进行交流也很重要。基罗斯建议家长选择安静的房间以避免被打扰。如果在谈话中就某些问题达成一致，就让孩子写在纸上，并放在一个显眼的位置，以约束双方共同遵守。

本文中PCR反应体系的组成为：引物各1.0μL，10×PCR Buffer 5.0μL，模版DNA 1.0μL，DNA Taq聚合酶0.4μL，MgCl25.0μL，dNTP 8.0μL，超纯水28.6μL。

PCR反应的步骤：首先94℃预变性5min，之后有个30个步骤的循环，这个循环的程序是94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸80s。这30个循环结束之后，72℃最终延伸10min。

PCR结束之后，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳来检测扩增效果。

1.2.5 DNA测序 在凝胶成像系统中观看PCR扩增结果，检测扩增是否成功。对于成功的亮带，利用回收试剂盒回收纯化PCR扩增产物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将上海生工生物工程技术服务有限公司反馈的序列结果，与GeneBank中核酸数据（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行对比分析，选择相似性高于97%的菌属，再将PCR分析结果与传统微生物分析的结果对比，看其二者之间的差异与共同性。

表2 即食海蜇分离出的菌株形态及特征Table 2 Characteristics of strains isolated from ready-to-eat jellyfish

表3 即食海蜇中各类腐败菌的生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria from ready-to-eat jellyfish

2 结果与分析

2.1 分离纯化后细菌的菌体形态和菌落特征

对所获细菌进行涂片、革兰氏染色、镜检，观察所获得的菌体在培养基上的菌落以及它的菌体形态，如表2所示。

2.2 细菌生理生化实验

根据菌种的细菌形态以及菌落特征，结合各种生理生化实验结果的鉴定，再查阅《常见细菌系统鉴定手册》，可以鉴定出A5、G3、I9是芽孢杆菌属，G5、I3是腐败希瓦氏菌，F3是假单胞菌。

2.3 PCR扩增结果分析

利用基因组提取试剂盒提取A5、F3、G5、G3、I3、I9的DNA，利用PCR扩增仪扩增其DNA片段，扩增结果于做凝胶成像系统分析拍照，结果如图1所示。实验结果显示，扩增的6个样品中，都获得了长度约在1600kbp左右的亮带，证明了本次实验获得的PCR扩增产物是实验菌株样品的16S rDNA的基因片段。

图1 PCR扩增结果Fig.1 The amplification results of PCR

2.4 基因序列对比分析

用回收试剂盒将PCR扩增的结果亮带进行切胶回收，回收物交于上海生工进行分析序列。在GenBank数据库里，将所得的16S rDNA序列进行Blast分析，选取相似度高于97%的菌株。将分析结果与传统的实验方法的鉴定结果进行对比，比较两者检验结果是否一致。

表4 16S rDNA序列对比分析及与传统检测方法对比Table 4 The results of comparative analysis about 16S rDNA and traditional detection methods

通过表4分析可知，F3与假单胞菌的同源性最高，为100%相似，其次A5、G3、I9与芽孢杆菌同源性最高，达到了99%，G5、I3与腐败希瓦氏菌的同源性最高，达到了98%。研究结果表明，即食海蜇的优势腐败菌为芽孢杆菌、假单胞菌以及腐败希瓦氏菌，这与传统方法鉴定出的结果一致。

3 结论

在本实验中，从即食海蜇中分离出来6种菌株，经过传统微生物鉴别如菌体特征、菌落形态、生理生化实验以及PCR扩增分子生物法分析，鉴定这6种菌株分别是假单胞菌、腐败希瓦氏菌以及芽孢杆菌，传统检测方法与PCR检测结果一致，为以后即食海蜇的保鲜技术提供了依据。

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[12]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].第1版.北京：科学出版社，2001：399-408.

Specific spoilage organism of instant jellyfish’s isolation and PCR technique

LOU Yong-jiang，LIU LI
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The conventional microbiological detection methods and PCR techniques was used to determine rapidly the specific spoilage organism of instant jellyfish.The results showed that：the identification consequence of PCR and traditional method was consistency，and the specific spoilage organism of instant jellyfish was Bacillus，Pseudomonas and corruption Shewanella.

PCR technique；instant jellyfish；the specific spoilage organism

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0207-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.036

2013－09－11

娄永江（1965-），男，硕士研究生，研究方向：水产品加工及质量安全控制。

宁波大学大学生科研创新计划项目（2011SRIP005）资助。