枳椇子、桑椹、青果复方组合物对小鼠肝脏的保护作用

唐晖慧，金美东（1.黄山学院旅游学院，安徽黄山245021；2.扬州大学旅游烹饪学院，江苏扬州225009；.黄山学院教育科学学院，安徽黄山245021）

枳椇子、桑椹、青果复方组合物对小鼠肝脏的保护作用

唐晖慧1，2，金美东3
（1.黄山学院旅游学院，安徽黄山245021；2.扬州大学旅游烹饪学院，江苏扬州225009；3.黄山学院教育科学学院，安徽黄山245021）

为研究枳椇子、桑椹、青果的水提物（质量比例为2.2∶3.8∶2.8）组成的复方组合物的保肝作用，以此复方组合物灌胃小鼠30d，对小鼠灌胃白酒，再测定肝脏组织中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）含量和乙醇脱氢酶（ADH）活性来评价复方组合物的保肝效果。结果显示，复方组合物的高、中、低剂量组可显著提高小鼠肝脏GSH含量（p＜0.01）和降低MDA含量（p＜0.01），而只有高、中剂量组可极显著降低TG含量（p＜0.01），高、中、低剂量组可显著激活ADH活性（p＜0.01），发挥出色的保肝护肝作用。本研究为复方组合物的保肝作用提供数据支撑。复方中三种植物都是药食同源植物，说明此复方可开发为保肝类保健食品。

保肝，桑椹，青果，枳椇子，组合物

酒精的代谢和分解多在肝脏中完成，因此大量饮酒会给肝脏带来很大负担。同时在酒精代谢过程中会产生许多代谢产物，如乙醛、自由基离子等。这些代谢产物的对机体的伤害都大于酒精本身，会引发炎症，造成肝细胞损伤，降低免疫功能，导致死亡[1]。机体大量摄入乙醇后，主要在乙醇脱氢酶（ADH）的催化下氧化为乙醛，并被乙醛脱氢酶氧化为乙酸盐类物质。因此认为ADH是乙醇代谢过程中的一种重要酶类，保持其活性能够加速体内乙醇的分解代谢，降低体内乙醇的蓄积[2]。乙醇大量氧化使得三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，致使脂肪在肝细胞内沉积[3]。同时乙醇能激活氧分子，产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽（GSH）消耗、丙二醛（MDA）升高，甘油三酯（TG）的代谢也会受到明显影响[4-5]。

酒精代谢过程中一系列代谢产物引起细胞和组织的氧化损伤，因此对酒精性肝损伤的研究广受关注[6]。近些年，在酒精性肝病的发病机制方面的研究取得了很大的进步，但是目前除了自觉限制饮酒量以外，药物对于该类损伤的治疗效果并不明显[7]。因此，研究天然药物对酒精性肝损伤的保护作用迫在眉睫。在前期工作中，本团队从古今重要解酒方中挑选出20余种药食同源植物作为研究对象，并从中筛选解酒功效最佳的天然提取物，经过优化发现枳椇子、青果和桑椹的水提物组成的复方具有较好的乙醇保持率和抗氧化活性[8]，但是此复方的保肝作用缺乏动物实验数据支撑。此外，复方中三种原料的解酒保肝效果已有报道，而三者配制组成复方还未见报道。本文通过灌胃小鼠复方组合物后，再经过灌胃白酒造成小鼠肝脏指标异常，测定不同组别小鼠的肝脏组织中GSH、MDA和TG的含量以及ADH酶活性来评价复方组合物的保肝作用，为以此复方开发解酒保肝类保健食品提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICR雌性小白鼠 体重（25±5）g，上海斯莱克实验动物责任有限公司；青果（Canarium album）、枳椇子（Hovenia duleis）、桑椹（Morus alba） 均购自黄山市华氏大药房；考马斯亮蓝G-250、甘油三脂试剂盒、丙二醛测试盒、谷胱甘肽过氧化物试剂盒、乙醇脱氢酶测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；海王金樽 广东深圳海王药业有限公司；56°红星二锅头白酒 北京红星酿酒厂。

Alpha-D2冻干机 德国Christ公司；电子天平 上海天平仪器厂；UV752N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复方组合物制备 分别取生药各1kg，各加入5L水，分别煎煮3次，每次1.5h，合并滤液，经负压（压强为10kPa，温度为30℃）蒸发浓缩5h，再抽滤，再减压（压强为10kPa，温度为40℃）浓缩至稠状，真空冷冻（压强为50Pa，温度为-55℃）干燥24h，经过研磨粉碎得到粗提物粉末。枳椇子、桑椹、青果三种提取物复方配制质量比例为2.2∶3.8∶2.8，置于-20℃冰箱保存备用。此复方的配制比例是根据本研究团队前期配方优化研究确定，已申请专利[8]。

1.2.2 动物分组 将72只ICR小鼠在（22±1）℃，湿度40%～60%，12h日夜交替，自由进食、进水的条件下适应性喂养一周后，随机分为六组。空白对照组（A组）12只：实验过程中不做任何处理，自由喂养；模型组（B组）12只：0.9%的生理盐水；低剂量组（C组）12只：浓度为50mg/mL受试配方样品；中剂量组（D组）12只：浓度为100mg/mL受试配方样品；高剂量组（E组）12只：浓度为150mg/mL受试配方样品；阳性对照组（F组）12只：浓度为25mg/mL的海王金樽溶液。

1.2.3 给药 每日经口灌胃给予20mL/kg·BW受试样品。空白对照组不做任何灌胃，自由进食、进水；模型对照组按体重给予生理盐水，连续给药30d。每周称重一次，根据体重调整用药量。给予受试样品结束时，将模型对照组及各样品组一次灌胃给予白酒15mL/kg·BW，空白对照组给蒸馏水[9]。

1.2.4 肝脏样品制备 末次给药后，禁食不禁水12h，将小鼠颈椎脱臼处死，解剖取出完整肝脏，预冷生理盐水清洗至洗液无血色后，吸干肝脏表面水分。剪取0.1g肝脏组织置于小烧杯中（于冰水），准备9倍（0.9mL）于肝脏组织重量的0.9%的生理盐水，转移总量2/3的生理盐水于烧杯中，尽快剪碎组织块，倒入玻璃匀浆器，再将剩余的1/3生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管进行匀浆，充分研磨后制成10%的组织匀浆，于离心机中以2000r/min离心15min，取上清液备用。

1.2.5 检测指标 小鼠体重：每周称量一次小鼠体重，直到实验结束，以考察受试样品对各组小鼠体重的影响。肝组织指标测定：各组肝组织中GSH、MDA和TG含量，ADH活性测定根据各试剂盒说明书操作步骤进行。

1.3 数据统计

数据均以（平均值±标准偏差）表示，组间差异采用SPSS 16.0进行单因素分析（ANOVA），以p＜0.05或p＜0.01确定差异是否有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 复方组合物对小鼠体重的影响

从表1可知，从实验开始到结束，各剂量组与模型组、空白组相比平均体重无显著差异（p＞0.05），在整个实验过程中，各组小鼠的体重都是持续健康正常地增长，各组小鼠也未因灌喂样品的原因而出现发育不良、体重减轻，说明本研究所选取的原料配方和剂量是安全的。

表1 不同组小鼠体重变化Table 1 Weights of different groups mice

2.2 复方组合物对谷胱甘肽含量的影响

肝脏谷胱甘肽（GSH）的总含量是评价药物醒酒保肝功能的一个重要指标。由表2可知，与空白组比较，模型组小鼠经白酒灌胃后，肝脏GSH含量极显著降低（p＜0.01），说明该模型造模成功。阳性对照组和复方组合物低、中、高剂量组小鼠肝匀浆中GSH含量与模型组相比极显著升高（p＜0.01），并且在一定范围内存在剂量的相关性。

已有文献报道，枳椇子乙醇提取物和水提物，及其与葛花提取物配伍后都未表现出提高醉酒大鼠肝脏GSH的作用，而其乙酸乙酯提取物高剂量组可显著提高醉酒小鼠肝脏GSH含量（p＜0.01）[10-11]；金银花、枳椇子和青果三者的提取物配伍的高剂量组可显著提高醉酒小鼠血清与肝脏中GSH含量（p＜0.05）[12]；由此可知，枳椇子水提物在维持大鼠肝脏GSH含量时表现并不出众，青果可能具有维持GSH含量的能力。

本实验中，各剂量组的小鼠肝脏GSH含量都较模型组有极显著提高（p＜0.01），高剂量组甚至比模型组高42.4%，优于已有报道中枳椇子提取物和金银花、枳椇子、青果提取物配伍的效果，更是接近灌胃海王金樽的阳性对照组，说明复方组合物能够维持肝脏GSH含量，对抗乙醇损伤引起的肝脏GSH耗竭，提高机体清除自由基的能力，从而对小鼠肝脏起到保护作用。

表2 受试样品对小鼠肝组织中GSH含量的影响Table 2 Effect of the tested samples on GSH in mice hepatic tissues

2.3 复方组合物对丙二醛含量的影响

由于GSH能在一定程度上阻止肝组织中脂质过氧化反应，而丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的产物之一，因此GSH浓度的降低会间接导致肝脏MDA含量的增加[4]。由表3可知，与空白组比较，模型组小鼠灌胃后，肝脏MDA含量极显著升高（p＜0.01），说明该模型造模成功。阳性对照组和低、中、高剂量组小鼠肝匀浆中MDA含量与模型组相比显著下降（p＜0.01），并且在一定范围内存在剂量的相关性。

已有文献报道，枳椇子乙酸乙酯提取物、醇提物和水提物可显著（p＜0.05）降低醉酒大鼠、小鼠肝脏MDA含量[10-11]；桑椹鲜果和果汁可显著（p＜0.01）降低醉酒大鼠血浆中MDA含量，但对肝脏MDA未表现出降低作用[13]；金银花、枳椇子和青果提取物配伍高剂量组可显著（p＜0.05）降低醉酒小鼠血清与肝脏中MDA含量[12]；由此可知，枳椇子、桑椹和青果都可降低醉酒大鼠、小鼠肝脏MDA含量，与模型组相比仅具显著水平（p＜0.05）。枳椇子醇提物和水提取物虽未表现出维持醉酒小鼠肝脏GSH含量的作用，但表现出降低肝脏MDA含量的作用，说明其可能是通过减少肝脏中脂质过氧化反应来发挥抗氧化作用。

本实验中，各剂量组小鼠肝脏MDA含量都较模型组极显著降低（p＜0.01），但是仍显著（p＜0.01）高于空白组，说明此复方并不能完全抵抗乙醇引起小鼠肝脏MDA含量升高的影响。此外，复方各剂量组的表现都优于前文列述的各种提取物和配伍组方的效果显著性水平（p＜0.05）。高剂量组中MDA含量较模型组降低达36.8%，接近阳性对照组含量，说明复方组合物能够减少乙醇引起的肝脏中脂质过氧化，发挥保护肝脏的作用。

表3 受试样品对小鼠肝组织中MDA含量的影响Table 3 Effect of the tested samples on MDA in mice hepatic tissues

2.4 复方组合物对甘油三酯含量的影响

当机体摄入大量乙醇时，乙醇在乙醇脱氢酶的作用下大量氧化，使得三羧酸循环和脂肪代谢受阻，使得甘油三酯（TG）在肝脏中不断堆积[5]，不但会诱发较为严重的心血管疾病，还会引发脂肪肝[14]。由表4可知，与空白组比较，模型组小鼠肝脏组织TG含量极显著升高（p＜0.01），说明该模型造模成功。与模型组比较，中、高剂量组和阳性对照组小鼠肝匀浆中TG含量极显著降低（p＜0.01）。

已有文献报道，枳椇子水提液可显著（p＜0.05）降低醉酒小鼠肝脏TG含量，并降低注射四氯化碳后小鼠肝脏TG含量，说明其可缓解肝脏TG含量偏高[15-16]；桑椹可显著（p＜0.01）降低高脂饲料喂养大鼠的血和肝中TG含量[17]；金银花、枳椇子和青果提取物配伍高剂量组可显著（p＜0.05）降低醉酒小鼠血清与肝脏中TG含量[12]；由此可知，枳椇子、桑椹和青果都有降低大鼠、小鼠肝脏TG含量，与模型组相比效果或高或低。

本实验中，复方体现了单一原料在降低肝脏TG含量的作用，各剂量组都表现出降低醉酒小鼠肝脏TG含量，并且中、高组都达到极显著水平（p＜0.01）。高剂量组中TG含量较模型组降低42.9%，说明此复方可降低醉酒小鼠肝脏组织TG含量，减轻肝脏脂肪堆积，起到保护肝脏的作用。

表4 受试样品对小鼠肝组织中TG含量的影响Table 4 Effect of the tested samples on TG in mice hepatic tissues

2.5 复方组合物对乙醇脱氢酶活性的影响

乙醇脱氢酶（ADH）活性被作为一项重要的检测指标，观察复方组合物对ADH是否具有诱导和激发作用。由表5可知，与空白组比较，模型组小鼠灌胃白酒后，肝脏ADH活性有所降低（p＜0.01），造模成功。阳性对照组和低、中、高剂量组中ADH活性相比于模型组和空白组有显著提高（p＜0.01）。

已有文献报道，枳椇子的水提液、醇提物、乙酸乙酯提取物和多糖都具有显著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝脏ADH活性的作用，但活力未超过正常组表现[18-20]；桑椹果饮可显著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝脏ADH活性，并高于正常组，说明其可激活ADH活性[21]；由此可知，枳椇子和桑椹表现出显著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝脏ADH活性。

本实验中，复方各剂量组小鼠肝脏ADH活性较模型组和空白组都有极显著（p＜0.01）提高，效果优于文献中枳椇子、桑椹单独作用的效果。高剂量组中ADH活性较空白组和模型组提高60%和77.8%，说明复方组合物不仅能保持小鼠肝脏ADH活性，还能激发ADH的活性，加速乙醇在体内代谢，降低乙醇对机体的负面影响。

表5 受试样品对小鼠肝组织中ADH活性的影响Table 5 Effect of the tested samples on ADH in mice hepatic tissues

本实验中复方组合物由枳椇子、桑葚和青果的提取物组成，中医认为，枳椇子具有解酒毒、解渴、降压利尿、镇痛镇静等功效[22]；桑椹具有解除酒精中毒、保护肝脏和肾脏免受损伤、强健骨骼等作用[23]；青果主要有防醉、消炎止痛和解除毒素的作用[24]。三种植物各自具有不同程度的提高肝脏GSH，降低MDA、TG含量，提高ADH活性的作用，发挥解酒保肝功效。结合以上结果可知，复方组合物集合了复方中三种植物的优势，超过单一组分的表现，对小鼠表现出良好的保肝护肝作用。

3 结论

经过高、中、低剂量复方组合物灌喂小鼠30d后，通过白酒灌胃造成小鼠肝组织中谷胱甘肽、丙二醛、甘油三酯含量和乙醇脱氢酶活性较正常状态明显异常，并测定此四项指标评价复方组合物的保肝作用。结果显示，复方组合物可显著降低小鼠肝组织中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽含量，激发乙醇脱氢酶活性，并表现出一定剂量相关性。说明本研究中复方组合物能加速体内乙醇的代谢分解，提高肝脏抗氧化活力，减少脂肪堆积，具有保肝功效。本复方中桑椹、青果、枳椇子为药食同源植物，能为开发解酒保肝类保健食品提供一定参考。

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Hepatoprotective effect of mixture of Hovenia duleis，Morus alba，and Canarium album on liver of mice

TANG Hui-hui1，2，JIN Mei-dong3
（1.Tourism College，Huangshan University，Huangshan 245021，China；2.School of Tourism and Culinary Science，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；3.School of Education Science，Huangshan University，Huangshan 245021，China）

The hepatoprotective effect of mixture from water extracts of Hovenia duleis，Morus alba，and Canarium album（mass ratio of 2.2∶3.8∶2.8）on mice was studied.Mice were reared with the mixture through stomach perfusion for 30 day，and mice were treated with white wine by gastric perfusion.The contents of GSH，MDA，TG and the enzyme activity of ADH were determined to evaluate the mixture.The results showed that high，middle，low dose groups of the mixture could significantly increase GSH（p＜0.01）in liver of mice，and decrease MDA（p＜0.01）.However，high，middle dose groups could significantly decrease TG（p＜0.01）.High，middle，low dose groups could significantly activated ADH（p＜0.01）in liver of mice.The mixture performed the hepatoprotective effect on mice.The work provided a strong data support for the hepatoprotective effect of the mixture.In addition，all of three plant materials in the mixture are the medicinal and edible plant，which could be developed as hepatoprotective health food.

hepatoprotective effect；Morus alba；Canarium album；Hovenia duleis；mixture

TS201.4

A

1002-0306（2014）12-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.069

2013－11－21

唐晖慧（1987-），女，硕士研究生，助教，研究方向：食品营养与烹饪性能研究。

黄山学院校级科研基金项目（2013xkj004）。