牛超低剂量性控分选冷冻精液人工授精试验

马梦婷，蔡 武，魏武军，陈晓莉，高庆华

（1.新疆生产建设兵团畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；2.新疆阿合奇县畜牧兽医局；3.新疆和田县畜牧兽医局)

牛超低剂量性控分选冷冻精液人工授精试验

马梦婷1，蔡 武2，魏武军3，陈晓莉1，高庆华1

（1.新疆生产建设兵团畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300；2.新疆阿合奇县畜牧兽医局；3.新疆和田县畜牧兽医局)

试验旨在检验使用超低剂量牛性控分选冷冻精液人工授精的效果。将180头牛分为3组进行人工授精，常规冷冻精液组（C，n=60）和经流式细胞分离的两种剂型（X1，n=60；X2，n=60）的X冷冻精液组，常规冻精有效精子数（1 125.1±109.4）×104，X1型和X2型冻精有效精子数分别为（102.3±9.6）×104和（51.9±4.8）×104。结果显示：X1型冻精和X2型冻精的90 d受胎率分别为53.3%和47.7%，低于常规冻精组的66.7%（P＜0.05)；X1型冻精和X2型冻精组母犊率分别为93.8%和100%，明显高于常规冻精组的43.9%（P＜0.05）。两种剂型X冻精和常规冻精配种所产犊牛出生重分别为33.7 kg±5.2 kg和34.4 kg±4.5 kg，差异不显著（P>0.05）；母牛妊娠期均在270～300 d的正常范围内。

奶牛；超低剂量分选精液；人工授精；产母犊率

控制减少雄性出生，增加雌性后代的比例，对快速增加良种牛数量有十分重要的意义［1-2］。目前，流式细胞分离精子授精是控制哺乳动物性别最为可靠的技术［3］。牛精子易于分选和冷冻，牛性控冻精已商业化，国内每支含2.3×106个精子（含有效精子1×106）的0.25 mL牛细管冻精的售价在150～300元人民币，其纯度和密度基本可以满足低剂量输精的要求［4-5］。但是，受专利和生产成本的限制，分选性控精液的高成本在今后相当长的时间内是限制其广泛用于生产的一个主要因素［2］，而通过提高性控精液的利用效率是当前降低成本的最重要途径。在奶牛、马鹿、梅花鹿和奶山羊性控精液的试验研究中，都曾有过使用了5.0×105甚至更低数量有效精子的输精剂量，这些试验已经获得了正常受胎率和预知性别的后代［6-7］，关键是要在生产中掌握精准的授精时间、输精部位，并结合输精前的促排技术。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆和田县和阿合奇县4个农业乡镇体况良好的青年杂交母牛180头；冷冻精液购自XY公司，3头公牛号为11035、03162、10203，每头公牛的X型冷冻精液采用0.25 mL细管分装，为2.5×106和1.2×106两种剂型，常规冷冻精液采用0.25 mL细管分装，为2.5×107/管，冻精活率均≥0.4，液氮保存；显微镜，胚胎移植枪及耗材（法国卡苏），液氮罐，磅秤。

1.2 方法

试验在2011年和2012年的4—6月进行，180头青年杂交母牛被分为X1、X2、C三组；观察牛的发情情况，以母牛爬跨其他母牛，同时接受其他母牛爬跨，并有吊线为发情特征，每天至少观察发情4次并记录；冻精细管在37℃温水中解冻，每组各取12个解冻细管样本，采用血球计数板间接法测定有效精子数（单位：104精子）。

C组60头当地青年母牛采用常规冷冻精液，在首次观察到发情牛稳定接受爬跨后12 h以1管常规冻精剂量进行一次人工授精，授精部位在子宫体；对120头当地青年母牛采用X型冷冻精液人工授精，时间为首次观察到发情牛接受爬跨后16 h，输精前直肠检查卵泡发育情况，在优势卵泡侧子宫角深部用胚胎移植枪进行一次直肠把握授精，3头公牛的两种剂型的X冻精间隔交替使用，每次1管性控冷冻精液；授精使用2.5×106剂型为X1组（60头），1.2×106剂型为X2组（60头）。人工授精后对90 d不返情母牛直肠检查定胎，统计情期受胎率（%），产犊后统计母犊率（%），妊娠时间（d），并测量其初生体重（kg）。

1.3 数据统计分析

有效精子数均数及标准差，90 d受胎率和产母率进行χ2检验，初生重和妊娠期数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 分选冻精和常规冻精人工授精结果比较

由表1可看出，每管X1冻精（0.25 mL）与每管X2冻精（0.25 mL）解冻后精子活力和有效精子数相比差1倍，其中X1冻精与常规冻精的有效精子数相差10倍。X1型冻精人工授精90 d受胎率为53.3%，X2型冻精90 d受胎率为47.7%，常规冻精为66.7%，X2型冻精人工授精90 d的受胎率低于X1型的，而X1型冻精人工授精90 d的受胎率又低于常规冻精的。X1型冻精和X2型冻精性控精液产母率分别达93.8%和100%，远偏离对照43.9%的母犊率。

表1 分选X型冻精和常规冻精人工授精结果对比

2.2 分选X型冻精和常规冻精所产母犊牛比较

由表2可看出，经流式细胞分离的X型和常规冷冻精液经人工授精，测量其后代出生重无显著差异（P>0.05），经X型冻精和常规冻精人工授精的母牛妊娠期都在270～290 d的正常范围之内。

表2 分选X型冻精和常规冻精所产母犊牛出生体重和妊娠期

3 讨论

超低剂量输精是本试验的主要特点，试验结果中两种低剂量性控精液的情期受胎率分别为53.3%和47.7%，虽比常规精液的情期受胎率（66.7%）低，但在生产中可以接受，性控效果达93%以上，并且妊娠期和胎儿出生情况与常规精液后代相比都正常。这个试验证明了采用商品性控冻精半剂量授精的可能性。

Seidel等发现在奶牛上采用低剂量或超低剂量输精也可达到常规70%的情期受胎率［7］，而对于我国农村乡镇牛场情期受胎率如能够达50%则较为满意，此次试验两种低剂量性控精液的情期受胎率分别为53.3%和47.7%。

当前推广分选的性控精液有两个主要问题：性控精液成本较高和情期受胎率低［2］。X型精液输精一次约200元，受胎1头约需要500元，远高于常规冻精的成本，但X型精液受机器分选效率的限制、专利使用费和市场因素的影响，其价格不会有大的下降，所以在保持情期受胎率基础上降低输精剂量是推动该技术更广泛应用的一个有效途径。

分离过程对精子会造成更多的损伤，而精子DNA的损伤可能会影响受胎率与后代的遗传稳定性［8-9］。已经有相当多的试验证实：同样剂量的性控冻精与常规冻精的受胎率没有差异，这说明不会显著影响受胎效果［9-10］。本试验中性控精液产母率达93%以上是令人满意的。X型精液人工授精后所产母犊早期出生重和怀孕期与常规冻精生产的后代没有差异，初步证明应用这个技术出生的性控后代的表型是正常的。

用分离X和Y精子的性控精液进行人工授精是控制家畜性别之最简单可行的方法。然而,低密度性控精液输精效果还不如常规人工授精,许多技术环节都有待改进［11-12］。挑选能够熟练从事胚胎移植操作技术的输精员，精确控制人工授精各个技术环节可以缩小性控与非性控、低密度与高密度精液之间的差别，获得高妊娠率。

［1］陆阳清，张明，卢克焕.流式细胞仪分离精子发展的研究进展［J］.生物技术通报，2005（3）：26-30.

［2］高庆华，韩春梅，孙献莹.哺乳动物X、Y精子分离研究进展［J］.中国男科学杂志，2008（8）：7-10.

［3］Johnson L A.Sexing mammalian sperm for production of offspring:the state-of-the-art［J］.AnimReprod Sci，2000，60-61:93-107.

［4］GarnerDL.Flowcytometricsexingofmammaliansperm［J］.Theriogenology，2006，65（5）：943-957.

［5］Garner D L，Seidel G E.Historyof commercializingsexed semen for cattle［J］.Theriogenology，2008，69：886-895.

［6］Q H Gao，H J Wei，J Luo，et al.Successful low dose insemination of flow cytometrically sorted Sika（Cervus nippon）sperm in wapiti（Cervus elaphus）［J］.Animal Reproduction Science，2010，118（1）：1，89-93.

［7］SeidelGE.Overviewofsexingsperm［J］.Theriogenology，2007，68：443-446.

［8］骆新荣，马瑛，孟浩，等.奶牛性控与常规冻精DNA损伤的彗星检测［J］.中国奶牛，2011（2）：6-8.

［9］Garner D L.Hoechst 33342：the dye that enabled differentiation of living X-and Y-chromosome bearing mammalian sperm［J］.Theriogenology，2009，71（1）：11-21.

［10］Sharpe J C，Evans K M.Advances in flowcytometryfor sperm sexing［J］. Theriogenology，2009，71（1）：4-10.

［11］Vazquez J M，Parrilla I，Gil M A，et al.Improving the efficiency of insemination with sex-sorted spermatozoa［J］.Reprod Domest Anim，2008，43（4）：1-8.

［12］Rath D，Johnson L A.Application and commercialization of flow cytometrically sex-sorted semen［J］.Reprod Domest Anim，2008，43（2）：338-346.

S823.3

A

2095-3887（2014）02-0022-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.007

2013-12-31

兵团博士资金项目（2010JC20）；兵团科技攻关计划课题（2011AB065）

马梦婷（1991-），女，硕士。

高庆华（1970-），男，教授，博士。主要研究方向：动物胚胎工程。