紫玉米籽粒花青素粗提液抗氧化活性研究

朱 敏，史振声，李凤海

（沈阳农业大学特种玉米研究所，辽宁沈阳 110866）

紫玉米籽粒花青素粗提液抗氧化活性研究

朱 敏，史振声，李凤海

（沈阳农业大学特种玉米研究所，辽宁沈阳 110866）

以不同基因型紫玉米籽粒中提取的花青素粗提液为研究对象，分析比较紫玉米籽粒总酚、花青素的相对含量。并对提取物的还原能力、清除超氧阴离子自由基、羟基自由基的能力进行测定，同时分析了紫玉米籽粒中总酚和花青素含量与体外抗氧化性的关系。结果表明，不同紫玉米品种花青素、总酚含量、还原力及清除羟基自由基和超氧阴离子自由基能力存在显著的基因型差异，其中FS7011花青素、总酚含量最高。紫玉米籽粒花青素和总酚含量与其还原力、清除羟基自由基及超氧阴离子自由基能力呈显著正相关。紫玉米富含花青素，具有较强的抗氧化作用，可用于开发天然抗氧化剂。

紫玉米，总酚，花青素，抗氧化活性

紫玉米（purple corn）是玉米的一个常规品种，素有“黄金食品”之称，其蛋白质、脂肪、矿物质含量均高于普通玉米。此外，紫玉米种皮富含花色苷类化合物，是天然色素的主要来源。花青素，又称花色素，是一种广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮化合物，主要存在于植物细胞液泡中，在不同的pH条件下，呈现五彩缤纷的颜色[1]。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、并且资源丰富，具有一定的营养和药理作用，在食品、化妆品、医药等行业有着巨大的应用前景。

赵晓燕等[2]认为花青素具有抗氧化、抗突变、延缓衰老、预防心脑血管疾病等多种生理功能。花青素的酚羟基结构使其对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，因而具有较好的生理活性。姜平平等[3]对紫甘薯花青素抗氧化活性研究得出，紫甘薯花青素在模型中表现出相当的还原力和清除羟基自由基的能力，并且与花青素浓度呈正相关。徐金瑞等[4]对黑大豆花青素含量与总抗氧化能力之间的相关性进行了分析，结果认为二者之间存在极显著的正相关性（p＜0.01），且黑大豆种皮花色苷提取物表现出较强的清除·OH、O2-·及有机自由基DPPH·的体外抗氧化作用。周波[5]通过体外实验测定玉米紫色植株花色苷色素在Fe2+引发的卵磷脂脂质体体系中抗氧化活性，得出紫色植株色素对脂质过氧化有明显的抑制作用，抑制率随样品的浓度增高而增大。本实验以从不同基因型紫玉米籽粒中提取的总酚、花青素粗提液为研究对象，分析比较总酚、花青素含量，测定花青素的还原能力、抗脂质过氧化能力、清除超氧阴离子自由基、羟基自由基的能力，同时分析了紫玉米籽粒中总酚和花青素含量与体外抗氧化性的关系，旨在评价不同基因型紫玉米可能的抗氧化生理活性，为筛选抗氧化能力强、总酚和花青素含量高的紫玉米种质资源，开发天然抗氧化剂提供理论和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料 本实验采用6个不同基因型紫玉米品种为原料，分别为ZS7511、ZS7615、ZF7139、FS7011、SF9538、FG5701 均由沈阳农业大学特种玉米研究所提供；磷酸盐、六氰合铁酸钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、邻二氮菲、硫酸亚铁、无水乙醇 均为分析纯。

721型分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司；电热恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；电热恒温干燥箱 郑州长城科工贸有限公司；恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；分析天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；雷磁pH计 上海雷磁仪器厂。

1.2 紫玉米籽粒花青素粗提液的制备

取紫玉米品种籽粒粉碎过60目筛，准确称取10.0g，用5%HCl与无水乙醇按1∶1混合作为提取剂，在60℃水浴中提取5h，过滤，分别取滤液1、2、3、4、5mL，用相同的提取剂定容至50mL，配制不同浓度的花青素样品粗提液备用[6]。

1.2.1 花青素的测定 用721型分光光度计测定不同浓度的花青素样品液在波长526nm处的吸光值A526nm。根据比尔定律，以吸光值表示提取液中花青素的相对含量。

1.2.2 总酚含量的测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 于10mL试管中一次加入1mL不同浓度梯度的没食子酸标准品（GAE）、1mL稀释3倍的福林酚试剂盒5mL 4%NaCO3溶液，于25℃水浴中放置30min，在765nm处测吸光度值，得GAE浓度与吸光值的回归方程：C（mg/L）= 8.3072A-0.08567（相关系数R=0.998）。

1.2.2.2 样品的测定 样品管以1mL样品代替没食子酸，参比管以1mL蒸馏水代替样品液，其余操作与上述标准管步骤相同。在765nm处测吸光度值，由标准曲线方程计算样品的总酚含量（以没食子酸计）。

1.2.3 还原能力的测定 采用普鲁士蓝法[7]测定天然色素的还原能力。取一定浓度的样品溶液0.5mL，分 别 加 入 2.5mL 0.2mol/L pH6.6 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 和2.5mL 1%的K3Fe（CN）6溶液，并混合均匀，将混合液在50℃水浴条件下保温20min后，迅速冷却，再向反应体系中加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和1mL 0.1%的三氯化铁，摇匀，10min后700nm下测定吸光值A700。用吸光值表示样品的还原能力。

1.2.4 抑制超氧阴离子能力的测定 采用邻苯三酚法[7]测定天然色素抑制超氧阴离子的能力。

1.2.4.1 邻苯三酚自氧化速率的测定 向10mL试管中加入4.5mL 0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液，同时加入1mL双蒸水，于25℃下恒温水浴20min，再加入3mL 25℃下预热的邻苯三酚溶液，迅速摇匀，倒入1cm的比色杯内，420nm波长处比色，每隔30s记录1次吸光值A420，将邻苯三酚自氧化速率控制在0.06mL/min左右。反应3min后，加1滴10mmol/L的HCl终止反应，静置5min后测得吸光值定为A0，可表示邻苯三酚自氧化速率。

1.2.4.2 样品抑制邻苯三酚自氧化的能力 在10mL试 管 中 加 入4.5mL 0.05mol/L pH8.2 的Tris-HCl缓 冲液，加入1mL样品，25℃下平衡4min，再按上述方法，测定邻苯三酚的自氧化速率，得到吸光值A1，同时作一试剂空白A2，依下式计算样品对邻苯三酚自氧化的抑制能力：抑制率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100。

1.2.5 羟基自由基清除能力的测定 参照金鸣等[8]的方法略有改动。取1mL 0.75mmol/L邻二氮菲于具塞试管中，依次加入2mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液和1mL蒸馏水，充分混匀后，再加入1mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液和1mL 0.01%H2O2，于37℃水浴60min，在536nm测其吸光值，所测得的数据为损伤的吸光度A0。未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中的1mL 0.01%的H2O2，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光度A1。样品管以1mL样品代替损伤管中的 1mL 0.01% 的 H2O2，操 作 方 法 同 损 伤 管 ，可 测 得536nm样品管的吸光度A2，则样品对羟自由基的抑制率S可由下式计算：S（%）=（A2－A0）/（A1－A0）×100。

1.3 统计分析

花青素和总酚含量与还原力、清除超氧阴离子自由基及羟基自由基能力之间的相关分析采用相关系数法。数据采用DPS7.0统计分析软件进行数据处理和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同基因型紫玉米籽粒中花青素含量的比较

图1 不同浓度样品液中花青素含量的比较Fig.1 Anthocyanin content of different purple corn kernel extract

不同基因型紫玉米籽粒不同浓度样品液中花青素的相对含量变化见图1，不同浓度的花青素反应体系中，随着样品液加入量的增加，反应液的吸光值不断增加。根据比尔定律说明，花青素的含量逐渐增多。ZF7193和FS7011花青素的含量要显著高于其他紫玉米品种，FG5701籽粒花青素含量最少，随着样品加入量的增加，吸光值变化幅度较小。

2.2 不同基因型紫玉米籽粒中总酚的比较

不同浓度花青素样品液中总酚含量如图2所示。总酚和花青素的含量变化趋势一致，随着样品加入量的增加，总酚含量逐渐增大，ZF7193和FS7011色素液中总酚的含量要显著高于其他紫玉米品种，6个紫玉米品种籽粒总酚含量：FS7011＞ZF7139＞ZS7511＞ZS7615＞SF9538＞FG5701。

图2 不同浓度样品液中总酚含量的比较Fig.2 Phenolic content of different purple corn kernel extract

2.3 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液还原能力的比较

一般来说，样品的还原能力与其抗氧化活性之间具有显著的相关性，还原能力的高低可以间接反映样品抗氧化能力的强弱。本实验对6个不同基因型紫玉米籽粒花青素提取液的还原能力进行了测定，并进行了比较，结果如图3所示。根据还原力测定的实验原理可知，在波长700nm处测定的吸光值越大，表明其还原能力越强。6个不同基因型紫玉米籽粒花青素提取液的还原能力随浓度的增加而增强。FS7011还原力的变化幅度最大，ZS7615的变化幅度最小，当加入5mL样品液时，ZS7615色素液还原力为1.665，FG5701色素液还原力为1.6564，FS7011为1.659，ZF7139为1.655，ZS7511与SF9538均为1.652，表明6种紫玉米籽粒花青素提取液均具有一定的还原能力，且还原能力强弱为ZS7615＞FG5701＞FS7011＞ZF7139＞ZS7511=SF9538。

图3 不同浓度样品液还原能力的比较Fig.3 Reducing power of different purple corn kernel extract

2.4 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液抑制超氧阴离子能力的比较

超氧阴离子自由基是一种氧自由基，与多种疾病有密切关系，可以通过一系列反应生成其他氧自由基，因此，研究其清除能力具有特别的意义。邻苯三酚在碱性条件下能够迅速发生自氧化，释放出超氧阴离子，在加入清除剂后能迅速清除自氧化产生的超氧阴离子自由基，从而降低邻苯三酚的自氧化速率。本实验采用邻苯三酚自氧化法测定了6个紫玉米品种籽粒色素液对邻苯三酚自氧化过程中产生的超氧阴离子的清除能力，由图4可以看出，在实验的5个浓度梯度范围内，6个紫玉米籽粒色素液对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的清除能力随浓度的增加而增强。当加入5mL样品液时，FS7011清除超氧阴离子自由基的能力最大为74.04%，ZS7615最小为65.01%。6种紫玉米籽粒花青素提取液对超氧阴离子自由基都有一定的清除能力，清除能力大小为：FS7011＞SF9538＞FG5701＞ZF7139＞ZS7511＞ZS7615。

图4 不同浓度样品液对超氧阴离子自由基清除率的比较Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activities of different purple corn kernel extract

2.5 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液清除羟基自由基能力的比较

6种不同基因型紫玉米籽粒粗提物清除羟基自由基能力见图5，从图5可以得出不同紫玉米籽粒粗提物对羟基自由基的清除能力不同。在实验浓度范围内，为了便于比较，采用加入1mL样品液时作图，由图5可知，样品中花青素对羟基自由基清除能力最强的是ZS7615，对羟基自由基清除率为98.4%，最弱的为FG5701，清除率为67.6%。6种紫玉米籽粒花青素提取液对羟基自由基清除能力大小为：ZS7615＞ZF7139＞ZS7511＞FS7011＞SF9538＞FG5701。

图5 不同浓度样品液对羟基自由基清除率的比较Fig.5 Super-oxide anion radical scavenging activities of different purple corn kernel extract

2.6 紫玉米抗氧化作用与花青素和多酚含量的相关性分析

由表1可以看出，紫玉米籽粒花青素粗提液中花青素的含量与总酚含量呈极显著正相关，相关系数达0.993。花青素和总酚含量与紫玉米的还原力及清除自由基能力呈极显著正相关，而紫玉米还原力与清除羟基自由基和超氧阴离子自由基能力之间也存在极显著的相关性，表明用这三项抗氧化指标来评价紫玉米的抗氧化性结果是一致的。

表1 紫玉米籽粒花青素素粗提液的抗氧化作用与花青素和多酚含量的相关性分析Table 1 Correlation of antioxidant activity with anthocyanins and total phenolics of anthocyanin crude extracted of purple corn kernel

3 结论与讨论

自由基具有高度的生理活性，是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物。人体内自由基过多就会导致膜质过氧化和细胞损伤，引起人体衰老、动脉粥样硬化、癌症等严重疾病。因此日常饮食中摄入一些抗氧化剂或自由基清除剂维持体内自由基代谢平衡是十分重要的[9]。徐亚明等[10]研究发现紫玉米花青素具有一定的还原能力，对超氧阴离子自由基有较好的清除能力，在实验浓度范围内，其最大清除率为77.45%。与本研究结果一致，这充分说明具有较好的抗氧化能力，从而为紫玉米花青素的进一步推广应用提供了依据[10]。本实验中6种紫玉米籽粒粗提物的还原力及清除超氧阴离子自由基及羟基自由基能力的强弱并不完全一致，可能是花青素对铁离子的螯合能力不同导致的，对于还原力的测定和清除羟基自由基的测定中均含有铁离子，这与Ilhami Gulcin等[1]的研究结果一致。此外，花色苷种类和含量差异也可能是不同紫玉米籽粒花青素粗提物之间抗氧化活性存在差异的原因。花青素粗提液中的有效成分不止一种，包括多种花色苷元、类黄酮及多酚物质，从而使得6种不同基因型紫玉米花青素粗提液还原力、清除超氧阴离子自由基及羟基自由基的强弱顺序有差异。

本实验研究结果表明，6种紫玉米花青素具有一定的还原能力及清除超氧阴离子自由基及羟基自由基的能力，说明紫玉米籽粒具有一定的抗氧化生理功能，为紫玉米花青素的推广应用提供了依据。不同紫玉米品种粗提液中花青素、总酚含量、还原力及清除羟基自由基和超氧阴离子自由基能力的变幅和变异系数较大，表明存在显著的基因型差异。但是不同紫玉米品种籽粒的花青素和总酚含量与其还原力、清除羟基自由基及超氧阴离子自由基能力呈显著正相关。花青素和总酚的含量可以作为评价其抗氧化活性的指标。在生产和应用中可以增加紫玉米花青素的浓度和纯度来提高抗氧化能力。紫玉米除籽粒富含花青素外，有些紫玉米品种的苞叶、穗轴、茎秆等器官也富含花青素，是紫玉米花青素提取的重要原料，可以利用紫玉米生产中的副产物来开发天然抗氧化剂。

[1]Ilhami G，Dali B，Akcahan G.Antiradical and antioxidant activity of total anthocyanins from perilla pankinensis decne[J]. Journal of Ethnopharmacology，2005（101）：287-293.

[2]赵晓燕，马越.番茄红素的溶剂残留去除及其延缓衰老作用的研究[J]. 华北农学报，2005，20（6）：107-108.

[3]姜平平，吕晓玲，姚秀玲，等.紫心甘薯花色苷抗氧化活性体外实验研究[J]. 中国食品添加剂，2002（6）：8-10.

[4]徐金瑞，张名位，刘兴华.黑大豆种皮花色苷的提取及其抗氧化作用研究[J]. 农业工程学报，2005，21（8）：161-164.

[5]周波，王晓红，郭连营，等.玉米紫色植株花色苷色素抗脂质过氧化作用[J].中国公共卫生，2008，24（1）：50-51.

[6]朱敏，史振声，李凤海，等.正交设计法优化紫玉米穗轴花青素提取工艺[J]. 食品研究与开发，2012，33（2）：122-125.

[7]刘杰超，王思新，焦中高，等.苹果多酚提取物抗氧化活性的体外实验[J]. 果树学报，2005，22（2）：106-110.

[8] 金鸣，蔡亚欣，李金荣，等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2-Fe2+产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.

[9]高俊玲，崔建忠，孙树勋.氧自由基检测技术的研究进展[J].华北煤炭医学院学报，1999，1（5）：403-404.

[10]徐亚民，赵晓燕，马越，等.黑玉米花色苷抗氧化能力的研究[J]. 农业科技与装备，2008（4）：83-85.

Antioxidant activity of anthocyanin crude extracted of purple corn kernel

ZHU Min，SHI Zhen-sheng，LI Feng-hai
（Shenyang Agricultual University，Shenyang 110866，China）

Anthocyanin crude extracted of different purple corn kernel were studied.The anthocyanin，total phenolic content and antioxidant activity including reducing power， hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities of purple corn kernel anthocyanin extract and the relationship between anthocyanin ，total phenolic content and antioxidant activity were also analyed.The result indicated that there were great differences in anthocyanin，total phenolic，reducing power，hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities among the six purple corn hybrids which FS7011 had the highest anthocyanin ，total phenolic content.The anthocyanin and total phenolic of purple corn anthocyanin had significantly positive correlation with reducing power，hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities.Purple corn grain had high content of anthocyanin and possessed strong antioxidant activity ，which could be used to develop natural antioxidants.

purple corn；total phenolic；anthocyanin；antioxidant activity

TS210.1

A

1002-0306（2014）22-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.011

2014－02－24

朱敏（1982-），女，博士，讲师，研究方向：紫玉米遗传育种及花青素开发利用。

国家自然科学基金（31301258）；辽宁省博士启动基金（20131101）。