ERK1／2信号通路介导丙泊酚对H2O2诱发的心肌细胞损伤保护作用

梁艳丽，唐 敏，徐聪敏

（广东湛江中心人民医院麻醉科，广东湛江524037）

ERK1／2信号通路介导丙泊酚对H2O2诱发的心肌细胞损伤保护作用

梁艳丽，唐 敏，徐聪敏

（广东湛江中心人民医院麻醉科，广东湛江524037）

目的研究丙泊酚对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用及其作用机制。方法采用胰酶消化法获取大鼠胎鼠心肌细胞，以H2O2损伤心肌细胞获得心肌缺血再灌注损伤实验模型；加入不同浓度丙泊酚（12.5、25、50μmol·L－1），MTT法检测细胞存活率；用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定各组细胞培养液中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性；流式细胞术检测细胞凋亡水平；Western blotting检测细胞中ERK1／2、Bcl－2及Bax的表达。结果丙泊酚（12.5、25、50μmol·L－1）能抑制由H2O2导致的细胞死亡（P＜0.01）；减少MDA的产生（P＜0.01），提高SOD活性（P＜0.01）；25、50μmol·L－1丙泊酚能抑制由H2O2导致的细胞凋亡（P＜0.05）；25μmol·L－1丙泊酚作用于细胞后能激活ERK1／2磷酸化，增加Bcl－2且减少Bax的表达。结论丙泊酚通过激活ERK1／2磷酸化对H2O2诱发的心肌细胞损伤起到保护作用。

丙泊酚；心肌细胞；ERK1／2；过氧化氢

丙泊酚（propofol）是一种静脉麻醉药，因起效快、苏醒迅速、平稳、副作用少而被广泛应用于临床［1］。丙泊酚对神经、心、肝、肾等多种器官都有保护作用［2，3］，但保护心肌细胞受损的作用机制还有待进一步研究。过氧化氢（H2O2）是体内氧化代谢的中间产物，当其浓度积累到一定的程度时会造成心肌细胞损伤。本实验利用离体乳鼠心肌细胞体外实验模型研究丙泊酚对以H2O2为代表的氧自由基诱发的心肌细胞损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生1～3 d的Wistar大鼠，购于广东医学院动物实验中心，动物生产许可证：SCXK（粤）2008－0008，动物使用许可证：SYXK（粤）2008－0007。

1.2 试剂 丙泊酚注射液购于西安力邦制药有限公司，使用前用培养液配制，过滤除菌待用；胎牛血清、DMEM（低糖）培养液、胰蛋白酶购于GIBCO公司；MTT、H2O2、Hepes、Glucose、L－glutamine、丙烯酰胺、SDS、Tris购于Sigma公司；ERK1／2、磷酸化ERK1／2、Bcl－2和Bax抗体购于Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶山羊抗鼠抗体IgG购于华美生物工程有限公司；丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、Tunel检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 大鼠乳鼠心肌细胞离体培养 取出生1～3 d的Wister大鼠乳鼠，无菌条件下取出心脏，放入预冷的D－hank′s瓶皿内洗去残余血液，剪掉心房，将洗净的心室肌放入大离心管内，用眼科剪快速剪碎，0.06%胰蛋白酶分次消化成单细胞悬液，离心收集沉淀，用含15%胎牛血清的DMEM培养液悬浮分散细胞，调整细胞密度约为1×10个·L－1接种到25 mL培养瓶中，CO2孵箱（5%CO2、37℃）培养。90 min后翻转培养瓶，取培养液接种到新培养瓶中。48 h换培养液，倒置显微镜下观察细胞全部贴壁，相互连接成片，形成同步搏动，细胞生长状态良好，即可进行下一步实验。

1.4 MTT法检测细胞存活率 取生长良好的心肌细胞，制成3.0×104个·mL－1细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μL。培养过夜后，吸出培养液，加入含有H2O2（100μmol·L－1）和不同浓度的丙泊酚（12.5、25、50μmol·L－1）。同时设置空白及模型组。每组设8个复孔。继续培养24 h后。每孔加入MTT（5 g·L－1）20μL，培养4～6 h。每孔加入DMSO 100μL。在微型振荡器上摇匀15 min，用ELX800型酶标仪在主波长为570 nm，参比波长为630 nm处测量OD值，比色以空白孔调零。

细胞存活率＝（实验组OD值－空白组OD值）／（对照组OD值－空白组OD值）。

1.5 细胞培养液中MDA含量及SOD活性的测定

分别取各实验组的细胞培养液，有硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。根据试剂盒说明书进行实验操作。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长良好的心肌细胞，制成3.0×105个·mL－1细胞悬液，接种于6孔板中，培养过夜后，更换含有H2O2和不同浓度的丙泊酚培养液。继续培养24 h后。弃培养液，预冷PBS洗2次，胰酶消化细胞，将细胞悬液转移到离心管中，1 000 rpm，离心5 min，收集细胞按Tunel试剂盒进行操作。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7 Western blot检测蛋白表达 取生长良好的心肌细胞，制成3.0×105个·mL－1细胞悬液，接种于6孔板中，培养过夜后，更换含有100μmol·L－1H2O2和50μmol·L－1的丙泊酚培养液。继续培养24 h后。弃培养液，预冷PBS洗2次，细胞刮刀刮落细胞，将细胞悬液转移到离心管中，1 000 rpm，离心5 min，提取细胞总蛋白。

采用Biorad法取总蛋白20μg进行电泳分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜，5%BSA液4℃封闭1 h后。加入不同一抗，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶山羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，ECL显色照相。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，各组间进行方差分析。

2 结果

2.1 丙泊酚对心肌细胞生长的保护作用

图1 丙泊酚对受损心肌细胞生长的影响

从图1可知，心肌细胞经100μmol·L－1H2O2处理24 h后，活细胞率32.8%±1.3%与空白对照组相比明显下降（P＜0.01）；而经不同浓度丙泊酚处理后，细胞的生长存活率均有所提高，活细胞率分别为49.7%±2.5%、63.4%±2.1%、90.3%±1.8%，与H2O2组有显著性差异（P＜0.01）。

2.2 丙泊酚对心肌细胞培养液中MDA和SOD含量的影响 在表1中，与对照组相比，H2O2损伤组MDA含量有明显的升高（P＜0.01），而丙泊酚各实验组MDA含量虽有不同程度的上升但上升幅度随着给药浓度的增加呈下降趋势，且与损伤组有显著性差异（P＜0.01）；H2O2损伤组能明显减少SOD的含量（P＜0.01），而丙泊酚各组与空白对照组比无明显变化，与模型组之间有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 丙泊酚对H2O2引起的心肌细胞凋亡的保护作用

表1 丙泊酚对心肌细胞培养液中MDA和SOD含量的影响

图2 丙泊酚对H2O2引起的心肌细胞凋亡的保护作用

由图2可以看出，H2O2能引起大量的心肌细胞凋亡，凋亡率为70.6%±3.1%；经不同浓度的丙泊酚处理后发现，25、50μmol·L－1的丙泊酚能明显的抑制由H2O2诱导的心肌细胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），凋亡率分别降为44.2%±2.7%和15.9%±2.5%。

2.4 丙泊酚对心肌细胞蛋白表达的影响 经H2O2作用24 h后，心肌细胞中ERK1／2磷酸化程度明显降低，Bcl－2表达减少，Bax表达增多。而经25 μmol·L－1丙泊酚处理后，能激活ERK1／2磷酸化，增加Bcl－2的表达，降低Bax表达，达到保护心肌细胞免受H2O2的凋亡诱导作用，结果如图3所示。

图3 丙泊酚对心肌细胞蛋白表达的影响

3 讨论

丙泊酚（propofol）是一种快速强效的全身麻醉剂，其临床特点是起效快、持续时间短、苏醒迅速而平稳、不良反应少，该药已广泛应用于临床各科麻醉及重症病人镇静。其作用机制还不十分明确，最近的实验发现丙泊酚除了对中枢神经系统有作用外，还对心血管系统、呼吸系统有一定的保护作用。其化学结构类似于内源性抗氧化剂维生素E和外源性抗氧化剂丁羟基甲苯，可直接与自由基反应使自由基灭活［4］。研究表明，丙泊酚可以改善离体心脏I／R的机械功能以及促进能量代谢的恢复，减少I／R所致的脂质过氧化产物的聚积，从而发挥其心肌保护作用［5］。但其对心肌细胞的保护机制仍不十分清楚。

近年来，缺血心肌再灌注技术，在临床上挽救了大量心肌缺血病人的生命，但由于再灌注本身也可引起心肌损伤而影响其疗效。心肌缺血时导致心肌细胞处于氧化应激状态，使心肌细胞内产生大量的自由基，而自由基的累积进一步会诱导心肌细胞损伤。许多研究证实通过外源性活性氧H2O2，能建立H2O2诱导心肌氧化应激的细胞模型［6～8］。在本研究中H2O2处理心肌细胞24 h后会引起心肌细胞凋亡并抑制细胞生长。而在培养液中同时加处不同浓度的丙泊酚则可在不同程度上保护心肌细胞免受H2O2的损伤。如图1的结果所示，12.5、25、50 μmol·L－1的丙泊酚作用于心肌细胞以后，能增加细胞的生长活性，与H2O2损伤组相比具有显著性差异（P＜0.01）。H2O2作用于心肌细胞以后不仅能抑制心肌细胞的生长还能诱导其出现凋亡，通过流式细胞仪检测我们发现25、50μmol·L－1的丙泊酚能够使细胞免于受H2O2损伤而出现凋亡，结果如图2所示。丙泊酚这种对细胞的保护作用与H2O2损伤组相比也存在着统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

氧自由基的大量合成能使心肌细胞膜中的不饱和脂肪酸受到攻击，从而导致MDA大量增加；另一方面储存的SOD因清除大量的超氧阴离子而消耗减少，从而导致氧化和抗氧化系统失衡，引起心血管组织的进一步损伤［9］。因此，自由基造成对心血管损伤的程度主要与MDA含量、SOD活性变化有关。本实验表明100μmol·L－1的H2O2能损伤心肌细胞，产生氧化应激，表现为MDA的水平上升（P＜0.01）和SOD的水平下降（P＜0.01）。而加入不同浓度的丙泊酚可以有效地抑制MDA的水平升高，同时能有效的维持SOD活性水平。提示丙泊酚可能通过增强机体消除自由基的能力，抑制脂质过氧化反应，而达到对心肌的保护作用。

ERK1／2是MAPK家族的抗凋亡激酶，有抗凋亡作用。研究证实，抑制ERK会导致细胞在自由基损伤时的凋亡增加，激活的ERK可促进胞浆靶蛋白磷酸化或调节其他蛋白激酶活性，促进多种转录因子磷酸化，增强转录活性［10］。我们的实验结果发现，丙泊酚能明显的激活ERK1／2磷酸化，激活后的ERK1／2可以通过转录依赖和非依赖方式增加抗凋亡蛋白Bcl－2，减少促凋亡蛋白Bax表达。

因此，在离体培养的大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型中，加入不同浓度的丙泊酚能明显降低细胞的氧化应激反应，保护心肌细胞受损；而ERK1／2信号通路介导丙泊酚对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用。

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ERK1／2 signal pathway mediated propofol protected on cultured rat cardiom yocytes damaged by H2O2

LIANG Yan-li，TANGMin，XU Cong-min
（Anesthesia Department，Central People′s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang 524037，China）

ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of propofol on cardiomyocytes damaged by H2O2.M ethodsCardiomyocytes from the hearts of 1～3－day－old neonatal rats were prepared by a modified method.Treated cultured rat cardiomyocytes by H2O2，propofol（12.5，25，50μmol·L－1）.MTTwas used to detect cell viability.Malondialdehyde（MDA）was determined by measuring thiobarbituric acid－reactive substances.Superoxide dismutase（SOD）was assayed by xanthine oxidasemethod.The rates ofapoptosis of cardiomyocytewere detected by flow cytometry.The expression of ERK1／2，Bcl－2 and Bax were tested by western blotting.ResultsPropofol suppressed the cardiomyocyte death induce by H2O2（P＜0.01），and decreased the production of MDA（P＜0.01），promoted the ability of SOD（P＜0.01）.The apoptosis rates of propofol group significant different from that of H2O2group（P＜0.05）.Propofol activated the phosphorated ERK1／2.The expression of Bcl－2 was increased while thatof Baxwas suppressed.ConclusionPropofol protected on cultured rat cardiomyocytes damaged by H2O2via ERK1／2 signal pathway.

Propofol；Cardiomyocytes；ERK1／2；H2O2

R614.1

A

2095－5375（2014）05－0257－004

梁艳丽，女，研究方向：麻醉学，E－mail：plliu78＠sina.com