白内障表观遗传学研究的现状及进展△

管怀进 康丽华

任何先天性或后天性因素引起的晶状体混浊使其透明性下降或颜色改变都可以称为白内障，它是全球第一位致盲眼病［1］。随着人口的增长和人口老龄化，白内障引起的视力损伤将越来越多，白内障盲将给社会造成沉重的经济负担。据世界卫生组织统计，全球有(4.0～4.5)千万盲人，其中一半由白内障引起［2］。目前白内障的病因及发病机制尚不明确。表观遗传学研究的出现，开拓了白内障基础研究的新途径。晶状体内的蛋白质90%为结构性蛋白——晶状体蛋白，包括α、β和γ三个家族。晶状体蛋白基因的表观遗传学改变，引起蛋白质表达失调、结构发生改变，可能是白内障形成的直接原因。而晶状体氧化损伤是白内障发生的主要机制之一，人体抗衡氧化损伤的过程是通过两套机制进行的——氧化损伤清除和氧化损伤修复。氧化损伤相关基因属于非晶状体蛋白基因，数目众多但含量微小，有关表观遗传学研究进展缓慢。然而，这些基因的功能对保持晶状体稳态和透明性至关重要，它们的改变很可能是白内障发生的始动因素，值得我们深入研究。

1 表观遗传学概述

1.1 表观遗传学 1942年英国生物学家Waddington［3］首次提出“epigenetics”这一专业术语，并将表观遗传学定义为“生物学的一个分支，研究基因型与表型之间关系的新的学科”。传统的遗传学理论认为，生物功能与表型完全取决于基因DNA序列，即基因决定表型，然而这不能回答同卵双胞胎出生后个体对疾病易感性等方面的差异，也不能解释环境的影响能否传给下一代;人类常见的疾病如心血管病、糖尿病、肿瘤的发生，以及眼科复合型疾病如单疱病毒的潜伏感染、青光眼、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等均不能用传统的遗传学理论解释。表观遗传学的问世为我们诠释了有深刻生物内涵的生物学现象，包括衰老［4-5］、炎症［6］及新生血管形成［7］等新的理论与实践基础。

1.2 表观遗传学与遗传学 表观遗传学认为，除DNA结构外，遗传信息以DNA甲基化、组蛋白修饰及小分子RNA干扰等方式进行表达及遗传，它主要是量的改变。遗传学则认为遗传信息存在于DNA上，而DNA序列的变化，也就是说DNA质的变化是基因变化的基础。表观遗传是一个渐变的过程，而遗传变异是突变。表观遗传变异是可逆的，而遗传变异是不可逆的。

表观遗传的变异多发生在启动子区，而遗传变异多在编码区发生。DNA序列是这两种遗传学的基础，但表观遗传学涉及何时、何地、以何种方式去应用、表达遗传信息及表观遗传学信号［8］。表观遗传学信息是较DNA编码的遗传信息更能对外界及微环境改变作出反应的生物调节因素。在整个生命过程中，表观遗传学与遗传学两者互相协同，相辅相成才能保持人体正常功能的发挥。

近年来国内外的研究发现，白内障的发生发展受遗传因素和表观遗传学多级联的复杂调控［9-12］。我们从年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)人群易感基因调查中发现:有些ARC患者OGG1和ERCC6等氧化损伤基因并无明显序列改变［13-14］。但已有研究证实，在老年大鼠晶状体中OGG1等氧化损伤相关蛋白质表达量显著降低［15-16］。如此基因的DNA结构和功能的不一致，提示氧化损伤基因的表达存在调控问题，即表观遗传学调控。表观遗传学修饰可以阐明DNA序列不变但编码的蛋白质却变化这一现象，也可从分子水平解释ARC的病因及发病机制。

1.3 表观遗传学主要研究内容 基因的表达除受控于DNA序列外，表观遗传因素起了极重要的作用。基因的表达需要改变染色质的状态，染色质状态过度紧密时基因的转录活性很低，而染色质状态疏松时基因转录的活性升高，染色质的这种状态的变化可以受多种表观遗传学修饰的调控。表观遗传现象不仅出现在发育过程中，而且应该是可遗传的基因改变。表观遗传信息可以经过有丝分裂或减数分裂在细胞核个体之间传递，并不依赖于DNA碱基序列的改变［17］。近几十年中，人们对表观遗传学的研究不断深入。它的主要研究内容是:(1)DNA甲基化;(2)组蛋白的修饰;(3)非编码RNA。

目前DNA甲基化是研究较多的表观遗传现象。它参与了许多重要的生命活动，如细胞分化、胚胎发育、多能干细胞发育、新生血管及肿瘤形成［18-19］。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的催化作用下，将甲基添加到CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上从而形成5-甲基胞嘧啶的反应。这种5-甲基胞嘧啶被称为基因组的第五碱基。随后又发现了5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，分别称为基因组第六、第七、第八碱基［20］。研究表明，CpG二核苷酸是主要的DNA甲基化位点。CpG二核苷酸在人类基因组中约占1%，在基因的某些区域中CpG二核苷酸出现的频率较高。如基因的启动子区和第一个外显子区，其CG含量＞50%，长度为500～1000 bp的区域称为CpG岛［21］。人类管家基因约有50%的启动子区有 CpG岛，并且均未甲基化［22］。一般而言，CpG岛的甲基化与基因沉默有关，即基因不表达或表达产物少，而去甲基化与基因活化有关。基因启动子的DNA甲基化对基因表达的调控尤为明显［23］。启动子区CpG岛的甲基化可导致基因表达的沉默。在对恶性肿瘤的研究中已发现大量抑癌基因的启动子区发生高甲基化、原癌基因启动子区低甲基化，以及全基因组DNA的低甲基化［22］。

组蛋白修饰是第二类最常见的表观遗传调节机制之一，组蛋白有两个活性末端:羧基端与氨基端。氨基端富含赖氨酸，有很多可变区，可以有乙酰化、磷酸化、甲基化等修饰发生。特别是组蛋白的乙酰化与去乙酰化的修饰构成了组蛋白密码，它可以被特定的蛋白质识别，以实现对特定基因的调节。一般而言，乙酰化与基因活化有关，而去乙酰化则与基因沉默有关。组蛋白甲基化通常也会导致基因的表达沉默［24］。组蛋白修饰与众多生理病理现象有关［25-26］。

非编码 RNA 包括 siRNA、microRNA 等［27-28］，这些小分子RNA由于不可以翻译成功能性RNA分子，故被称为非编码RNA。很多研究表明，非编码RNA尤其是microRNA在表观遗传修饰中起了非常重要的作用，能在基因水平与染色体水平对基因表达进行调节。microRNA已经成为生物医学研究的热点之一，特别是在肿瘤中，如果某种肿瘤特异性表达某一种microRNA，则该microRNA就有可能用于肿瘤的早期预测。microRNA可以通过各种方式调控基因表达与表观遗传。microRNA可以直接结合到DNA，也可以与基因的启动子区或3’非翻译区结合，从而影响基因的表达。总之，microRNA影响基因表达的方式多样化且复杂。除此之外，microRNA还可以与DNA甲基化、组蛋白乙酰化等交互作用，构成极复杂的细胞基因调控网络系统。

2 表观遗传学与白内障

2.1 DNA甲基化与白内障 DNA甲基化在眼部基因表达中起着关键的调节作用。异常甲基化已经被证实与白内障、AMD、翼状胬肉和视网膜母细胞瘤等眼科疾病相关［29］。已有很多学者报道了αA-晶状体蛋白(αA-crystallin，CRYAA)对保持晶状体的透明起着关键作用［30-32］。Zhou 等［33］研究了15 例核性 ARC患者和15个年龄匹配的正常透明晶状体上皮细胞中CRYAA基因的表达发现，CRYAA基因在核性ARC患者的晶状体上皮细胞中表达明显下调，并且该基因启动子区有明显的高甲基化。去甲基化药物处理培养的人晶状体上皮细胞株后能使CRYAA基因的表达上调。这项研究表明DNA甲基化在核性ARC的形成中起一定的作用。但该研究未能进一步阐明DNA甲基化与转录因子功能之间的关系。在另外一项研究中，Palsamy等［34］研究了糖尿病性白内障。核因子E2相关因子是能激活多种抗氧化酶的中心物质，而一种肿瘤抑制因子胞质接头蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)能够结合到核因子E2相关因子分子中导致其蛋白酶体的降解。Keap1启动子区在糖尿病患者的晶状体上皮细胞中呈低甲基化，而在透明晶状体上皮细胞中保持高甲基化，并且发现在正常透明晶状体上皮细胞中随着年龄的增加其启动子区的甲基化程度会降低，所以可能Keap1低甲基化引起蛋白酶体的降解，导致晶状体上皮细胞抗氧化能力的下降。这一机制与糖尿病性白内障及ARC的形成可能有密切关系。在多种肿瘤细胞株中Keap1启动子区呈现高甲基化，如前列腺癌［35］、肺癌［36］。至于在白内障患者晶状体上皮细胞中为何出现低甲基化还需进一步研究。

2.2 组蛋白修饰与白内障 许多蛋白质的乙酰化水平因在白内障的发生和发展过程中起到了一定的作用而受到广泛的关注和研究［37-38］。蛋白质乙酰化是指蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，而此过程主要由乙酰基转移酶和去乙酰化酶共同调节完成，这些酶分别被命名为组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)，因为它们最初发现时是作用于组蛋白的［39］。蛋白质的许多特性是通过其赖氨酸位点上的乙酰化来调节的，包括DNA与蛋白质的相互作用、细胞定位、转录活性和蛋白质的稳定等［40-42］。

基于HATs序列的相似性，可以分为3组，即Gcn5/PCAF家族，包括 Gcn5、PCAF和Gcn5L;p300/CBP家族，包括CBP和p300;MYST家族，包括Esa1、MOF和 TIP60［43］。在哺乳动物中，p300/CBP 在细胞生长、肌管分化以及细胞凋亡的过程中发挥了重要的作用［44-46］。此外，PCAF在调节肌丝收缩活动及脂肪细胞增殖中发挥了关键作用［47-48］。TIP60也参与了许多生理过程，包括p53通路的调节、DNA损伤的修复和细胞的凋亡等［49-51］。

HDACs是表观遗传学基因组的一种重要调节因子。真核生物的HDACs主要分为四类:Ⅰ类是与酵母RPD3具有同源性，主要存在于细胞核中，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8;Ⅱ类是与酵母HDA1具有同源性，主要存在于细胞质中，但在细胞核中也有表达，包括 HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10;Ⅲ类是沉默信息调节因子2相关酶类，它对HDAC的抑制剂不敏感，包括SIRT1-7［52］。由于HDACs对转录抑制起比较重要的作用，近年来大量的HDACs家族成员及其抑制剂成为了一个研究的热点。

Dairou等［53］发现在人晶状体上皮细胞中确实存在 N-乙酰转移酶(N-acetyhransferases，NATs)，它们是存在于晶状体上皮细胞内的具有解毒和代谢药物、化学物质的酶，包括NATl和NAT2两种同工酶，分别由NATl基因和NAT2基因编码。NATs的表达在氧化应激和光氧化应激过程中明显降低，故此人们认为NATs的下降可能会促进白内障的形成。NAT2基因(定位于11q8)包含许多基因多态性，可编码效率快或慢的NATs，已有大量文献证明NATs慢乙酰化与各种癌症的相关性。Tamer等［54］发现，在土耳其人群中，NATs慢乙酰化群体比NATs快乙酰化群体对于紫外线、烟酒等解毒能力弱，患ARC风险增加，提示NAT2基因多态性可能对ARC发病产生影响。另外，有研究证明βH-晶状体蛋白内确实存在乙酰化修饰，并且这种修饰是与年龄相关的［55］。研究表明，人眼晶状体的皮质和核内存在N端乙酰化的α、β晶状体蛋白，虽然它们的功能和特性尚不明确，但如其他改变表面电荷的修饰一样，乙酰化可能会影响α晶状体蛋白的功能，从而影响白内障的病理过程［56］。近来还发现编码一个高度保守的乙酰辅酶A转运体基因的突变会导致先天性白内障的发生［57］。

2.3 非编码RNA与白内障 近几年随着人们对microRNA研究的不断深入，人们发现表观遗传相关的三个主要因素(DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA)是通过互相影响来决定基因表达的［58］。已有研究发现多种microRNA在人和大鼠的透明晶状体和白内障晶状体中表达有差异［59］，microRNA在白内障患者房水中表达亦有不同［60］。Chien 等［61］证实了microRNA-34a的表达与核性ARC、皮质性ARC或后囊下性ARC晶状体混浊程度呈正相关。这些结果表明了microRNA-34a的表达在衰老的晶状体中发挥了重要作用。Iliff等［62］也已经证实了 microRNA-184单个碱基替换会导致内皮营养不良、虹膜发育不全、先天性白内障和基质变薄(EDICT综合征)。在小鼠继发性白内障中，microRNA-184和microRNA-204竞争性结合发挥RNA网络的作用［63］。除了 microRNA在调节白内障时发挥了作用，已有的研究已经证明了siRNA也参与白内障的形成和发展。Park等［64］研究发现 NF-κB的 siRNA能有效地抑制体外晶状体上皮细胞迁移和增殖，降低白内障手术后后囊膜混浊的形成。Huang等［65］研究也发现白内障术后siRNA靶向干预EGFR可以有效抑制后囊膜混浊。除此之外，Wang等［66］研究发现microRNA、siRNA可以共同参与调节基因表达，通过siRNA干预SMAD4，microRNA-204-5p可以调节后囊膜混浊后上皮间充质转换。

3 未来研究方向

涉及细胞生长关键基因的表观遗传学调节失活是ARC疾病发生发展的特点。这些表观遗传学机制主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、非编码RNA等，它们影响基因表达，并且与疾病进展相关。与基因突变相比较，表观遗传学的改变具有潜在的可恢复性，表观遗传学失活的基因的重新表达能抑制疾病状态或者对某些疾病治疗敏感性起到一定的调节作用。能够逆转表观基因失活的小分子称为表观治疗药，此类药物未来可能成为ARC疾病防治的热点和重点。

随着表观遗传学研究的深入，一些新的问题亟待解决。(1)就眼科疾病而言，白内障、AMD等均为变性性疾病，这些病的发病机制到目前为止尚未完全阐明，其表观遗传标志是什么，哪些表观遗传学因素在白内障的发生发展过程中起了关键作用，哪些是次要作用?(2)表观遗传因素如何参与维持眼部各种正常生理功能?(3)病理状态下，表观遗传因素如何调节变性及衰老过程，氧化应激反应、氧化损伤清除与修复分子又是如何与表观遗传分子相互作用的?因此，发现具有表观遗传学特异性的小分子治疗药是眼科研究突破的当务之急。

3.1 去甲基化药物研究应用 DNA的甲基化作为表观遗传学的重要调节机制，参与了多种眼病的发生发展以及眼部组织的正常发育［67］。因为DNA的甲基化是可逆的，去甲基化药物可以提高基因的表达，如果确定了某一疾病与高甲基化有关，使用去甲基化药物干预后则可起到治疗的目的。目前抑制DNA的甲基化酶已成为防治肿瘤的新思路，应用DNA甲基化抑制剂 5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-AZA)一类的药物不仅可以阻断肿瘤生长，还可使沉默的抑癌基因活化。此外，表观遗传学治疗可以提高细胞对化疗、干扰素及免疫疗法的敏感性。表观遗传学治疗还展示了对炎症、新生血管性疾病及变性病变的良好潜在的治疗价值。最近研究提示，白内障手术后后发性白内障的发生与DNA甲基化有密切关系，抑制DNA甲基化有可能防止后发性白内障的发生［68］。但是眼病DNA甲基化的调节机制研究还不是很透彻。在基础研究方面，启动子区不同位点的CpG甲基化对转录调控是否有差别影响还不清楚。去甲基化不完全等问题也是该领域值得研究的一个方面。已有研究表明，如果去甲基化药物全身给药会导致全基因组的低甲基化，从而导致相应副作用的产生［22］。大部分眼科疾病其发病是多因素的，单纯从DNA甲基化方面尚不能完全解释其发病机制。当前该领域的研究大多为小样本量，不足以得到明确的结论。随着表观遗传学研究的不断深入，相信DNA甲基化在眼科疾病中的作用会进一步阐明，为一些眼科疾病的防治打开新思路，提供新途径。

3.2 组蛋白酶的应用 表观遗传学的研究在过去的十几年里迅速增多，这使我们对人类的许多疾病有了更好的认识［69］。其中，组蛋白和非组蛋白的乙酰化/去乙酰化水平在许多疾病中发挥了重要的作用，例如帕金森病、胆石病和神经退行性疾病等［70-72］。表观遗传学治疗已在多种疾病的动物模型中进行了广泛研究，5-AZA及组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)已在美国进行临床试验。除了5-AZA或HDACI分别应用外，也有报道将二者合用可取得很好的协同效果［73］。仅组蛋白去乙酰化酶抑制剂目前就多达300多项临床实验正在进行。有研究应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸治疗视网膜色素变性取得了较好的临床效果［74］。并且组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA也已进入临床试验中［75-76］。近年来，对乙酰化在眼科疾病中作用的研究也越来越多。虽然已经取得了很大的进步，但仍然存在着许多的问题和挑战。蛋白质的乙酰化水平在不同的眼科疾病和不同的个体中是否存在差异?乙酰化在许多眼部疾病中到底发挥的是关键作用还是辅助作用?蛋白质的乙酰化水平在许多致盲性眼病中是否存在标记物?如何提高表观遗传治疗药靶细胞的特异性?未来，我们将致力于研究乙酰化作用对白内障的调节机制，通过对其机制的研究，进一步探究乙酰化的激动剂或抑制剂对白内障的治疗作用，使之最终成功运用于临床。

3.3 药物敏感性基因疗法、药敏基因疗法、耐受基因疗法 人体的许多性状表达差异、对药物或某种疾病的易感程度等等都可能与表观遗传学有关。影响白内障患者对治疗反应的因素很多，从药物遗传学角度来分析，有很多基因对其有影响，涉及药物吸收、转运、代谢、排泄、作用靶点及信号转导等过程的DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学均可能影响治疗敏感性，因此，寻找表观遗传学与药物治疗敏感性最大关联的因素尤为重要。

表观遗传学与药物反应的关联:药物的摄入是环境因素对人的影响之一，许多药物的代谢酶、载体及药物靶点均受表观遗传因素的影响。临床上抗药性的产生及菌株的变异很可能与表观遗传调控失调有关。另外，医疗实践中一个最常见的现象就是存在有害药物反应的个体化差异。最近研究发现，这种差异与DNA的甲基化有密切关系，DNA甲基化尤其是在调控细胞色素超家族某些代谢酶中起重要作用。细胞色素P450的个体表达差异是个体对药物反应不同的原因，而P450的表达又受DNA甲基化的调控［74］。此外，药物诱导的耐药性基因的表达与组蛋白H3的乙酰化及H3K4甲基化有关。因此，研究白内障相关基因的表观遗传学功能，不仅对人类基因功能研究的完善起到补充作用，同时对研究白内障的发病机制也具有重大意义。

1 葛坚.眼科学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2013:203-226.

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