高效体积排阻色谱-示差折光检测器-多角激光光散射仪联用测定右旋糖酐70原料药的分子质量

阚微娜，滕艳坤，杨宏伟（辽宁省食品药品检验所，沈阳 110023）

右旋糖酐，又名葡聚糖，是一种由若干葡萄糖脱水形成的高分子聚合物，普遍应用于医药领域，可提高血浆胶体渗透压，吸收血管外的水分以补充血容量，从而维护血压扩充血容量的强度。临床医学上应用最普遍的右旋糖酐有3种，根据分子质量大小分为右旋糖酐20、右旋糖酐40 和右旋糖酐70，均系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226 号菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，再经处理精制而得[1]。分子质量及其分布是表征右旋糖酐的重要参数。右旋糖酐70是目前公认的优良血浆代用品之一，《中国药典》要求右旋糖酐70 的重均分子质量（Mw）应为64 000～76 000[2]。

国际常见药典中[2-4]均规定了右旋糖酐70的分子质量的测定方法，即高效体积排阻色谱法（HPSEC）。《中国药典》方法中需要使用不同分子质量的对照品，采用示差折光检测器（RID），通过GPC分析软件，绘制标准曲线测定样品的分子质量及其分布。笔者发现，使用不同来源的对照品测定同一右旋糖酐70的分子质量，结果会出现一定的差别。为此，笔者试图建立一种不需要对照品即可测定右旋糖酐分子质量的HPSEC方法。经不断试验，笔者最终建立了HPSEC法与RID、多角激光光散射仪（MALLS）联机测定的方法，其中RID仍然为第一检测器，MALLS 为第二检测器。由于MALLS 为分子质量响应型检测器，因此不需要已知分子质量的对照品校正色谱柱，可直接测得样品的绝对分子质量[5]。笔者使用建立的方法对3批右旋糖酐70原料药进行了测定，并将结果与采用《中国药典》方法[2]分别用3种不同来源对照品计算得到的样品分子质量结果进行了比较，结果表明建立的方法高效、准确，可以直接测定样品的分子质量。

1 材料

1.1 仪器与软件

LC-20A 型HPLC 仪，包括LC-20A 泵、SIL-20A 自动进样器、CTO-20A 柱温箱、RID-10A RID（日本岛津公司）；18 角度激光光散射仪（波长：632.8 nm）、ASTRA4.90.08 软件（美国Wyatte公司）；凝胶色谱软件GPC 2010版（北京龙智达公司）。

1.2 药品与试剂

右旋糖酐分子质量对照品[中国食品药品检定研究院（以下简称中检院），批号分别为：140641-201002、140642-201002、140643-201002、140644-201002、140645-201002，峰位分子质量Mp分别为：10 000、21 400、41 100、84 400、133 800]；葡聚糖分子质量对照品P82（日本Shodex 公司，批号：51104，Mp分别为：22 800、47 300、112 000、212 000）；Fluka 葡聚糖分子质量对照品（美国Sigma公司，批号：BCBG8021V，Mp分别为：23 800、48 600、80 900、147 600、273 000）；右旋糖酐70原料药[山东某药业公司，批号：A（120501）、B（110701）、C（100601）]；叠氮化钠、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPSEC-RID-MALLS方法

2.1.1 供试品溶液的配制。取供试品适量，加流动相适量稀释至10 mg/ml。

2.1.2 色谱条件。色谱柱：TSK-GEL G4000SWXL（30 cm×7.5 mm，5 μm）；流动相：0.2 mol/L 氯化钠水溶液（内含0.02%叠氮化钠），流速：0.8 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20µl；采集时间：20 min。RID常数：4.88×104；dn/dc值：0.135 ml/g；延迟体积：0.4 ml。分析软件为ASTRA4.90.08。

供试品溶液（批号：A）色谱图见图1。

图1 样品A色谱图1.RID谱图；2.MALLS谱图Fig 1 Chromatograms of sample A1.RID chromatograms；2.MALLS chromatograms

2.1.3 精密度试验。称取Mw为80 900 的Fluka 葡聚糖分子质量对照品10 mg，加流动相1 ml，制成10 mg/ml的标准溶液，放置过夜。精密量取0.1 ml，注入色谱仪，连续进样5次，测得Mw平均值为81 000，RSD＝0.66%（n＝5），平均值与标准值（80 900）之差为100，相对误差为0.13%。

2.1.4 重复性试验。称取右旋糖酐70 原料药（批号：A）50 mg，加流动相5 ml 溶解，共配制6 份，放置过夜；精密量取20µl，注入色谱仪。结果，6 份样品Mw平均值为65 680，RSD＝0.9%（n＝6）；10%大分子部分重均分子质量（M10）平均值为121 600，RSD＝1.1%（n＝6）；10%小分子部分重均分子质量（M90）平均值为47 670，RSD＝0.95%（n＝6）。表明方法重复性良好。

2.1.5 样品分子质量测定。取3批样品，按“2.1.1”项下方法配制供试品溶液，注入色谱仪，测定3批供试品的Mw、M10、M90，结果见表1。

表1 HPSEC-RID-MALLS 法测定3 批样品分子质量结果（n＝2）Tab 1 Results of molecular weight of 3 batches of samples by HPSEC-RID-MALLS（n＝2）

2.2 《中国药典》方法（HPSEC-RID方法）

2.2.1 色谱条件。色谱柱：TSK-GEL G4000SWXL（30 cm×7.5 mm，5 μm）；流动相：0.71%硫酸钠水溶液（内含0.02%叠氮化钠），流速：0.5 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μl；采集时间：25 min。分析软件为GPC。

2.2.2 溶液配制。对照品溶液：称取Mp在15 000～200 000之间的3 种来源对照品约10 mg，分别用1 ml 流动相溶解，放置过夜，配制成3 种来源的对照品系列溶液。供试品溶液：同“2.1.1”项。

2.2.3 不同来源对照品标准曲线的绘制。取“2.2.2”项下配制的不同来源的对照品系列溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件测定，并采用GPC软件，以保留时间（T，min）为横坐标、分子质量（M）的对数为纵坐标，进行线性回归，并绘制3 种来源葡聚糖对照品的标准曲线，结果3 种来源对照品线性关系良好，见表2。

表2 3种来源葡聚糖对照品线性关系Tab 2 Linear range of 3 brands of dextran standard

2.2.4 样品分子质量测定。取3批供试品，按“2.1.1”项下方法配制供试品溶液，注入色谱仪，分别使用表2 中的3 个标准曲线方程计算3批样品的Mw、M10、M90，结果见表3。

表3 HPSEC-RID法测定3批样品分子质量结果（n＝2）Tab 3 Results of molecular weight of 3 batches of samples by HPSEC-RID（n＝2）

3 讨论

3.1 不同来源对照品对测定结果的影响

由表3 数据可知，采用Fluka 葡聚糖对照品与中检院右旋糖酐对照品绘制的标准曲线方程分析3批样品，这两种方法的测定结果较为接近；而采用Shodex 公司葡聚糖对照品得到的样品的结果偏低，甚至低于《中国药典》规定的限度[2]，这为质控结论的判定带来一定的困难。中检院的右旋糖酐对照品与Fluka葡聚糖对照品所使用的葡聚糖均为蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226 号菌发酵后生成的高分子葡聚糖聚合物再经精制而得，系与右旋糖酐同源的菌株发酵而来，而Shodex公司葡聚糖对照品使用的葡聚糖来源不清楚，由此初步分析可能是葡聚糖的来源与样品来源有区别而导致测定结果偏低。因此，采用不同来源、不同类别的对照品对样品进行GPC 分析时，经普适校正后更为合适。

3.2 HPSEC-RID-MALLS法与HPSEC-RID法结果比较

由表1和表3中的数据可知，采用HPSEC-RID-MALLS法的结果与采用HPSEC-RID法、中检院与Fluka葡聚糖对照品的Mw结果相近，但是M10、M90的结果差别较大。因此，尽管两种方法均采用凝胶色谱分离，但检测和计算的手段完全不同。笔者认为，从原理上讲，HPSEC-RID-MALLS 法测定的结果应更接近样品分子质量的真值。

3.3 HPSEC-RID-MALLS法优势

HPSEC-RID-MALLS 法不需要对任何标准物质进行校正和标定，具有较高的准确性和重复性，操作简单，可实现连续性测定，同时还可用于分子质量对照品的标定，因此在质量控制和应用研究中具有更广阔的前景。

[1]韦肖锋.关于右旋糖酐生产新工艺的探讨[J].企业科技与发展，2012（3）：12.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：114.

[3]美国药典委员会.美国药典[S].34版.华盛顿：美国药典委员会，2011：2 521.

[4]英国药典委员会.英国药典[S].2010年版.伦敦：英国药典委员会，2010：655-656.

[5]李京，范慧红.高效体积排阻色谱与多角激光光散射仪联机测定低分子肝素分子量及分子量分布[J].中国药学杂志，2009，44（2）：140.