多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

董子龙武妍婷张生彬

多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

董子龙①武妍婷①张生彬①

目的：探讨结直肠癌组织中多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白的表达情况及临床意义。方法：购买结直肠癌组织芯片标本90例（实验组），正常结直肠组织芯片70例（对照组），采用原位杂交和免疫组化染色方法，检测两组PTN mRNA及其蛋白的表达；另选择2009年11月-2013年12月手术治疗的原发结直肠癌患者90例，分析PTN mRNA及其蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果：实验组PTN mRNA阳性表达率为62.2%，PTN蛋白阳性表达率为58.9%，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别及不同肿瘤类型之间，PTN mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；不同TNM分期和不同分化程度，PTN mRNA及其蛋白阳性表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：PTN mRNA及其蛋白与肿瘤分期和分化程度有密切关系，可作为判断结直肠癌预后的参考依据。

多效生长因子； PTN蛋白； 结直肠癌组织

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，具有较高的死亡率，我国作为结直肠癌的高发国家，其发病率呈显著上升趋势[1-2]。PTN作为重要的生长因子，具有多信号功能，能够促进神经系统发育、血管发生及刺激细胞增殖和迁移[3-4]。本文回顾性分析PTN在结直肠癌组织中的表达情况，旨在为判断预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 购买由陕西超英生物科技有限公司生产的结直肠癌组织芯片标本共90例（实验组），正常结直肠组织芯片70例（对照组）。另选择2009年11月-2013年2月手术治疗的原发性结直肠癌患者90例，男52例，女38例；年龄20～75岁，中位年龄53岁；其中＜55岁共43例，≥55岁共47例；直肠癌37例，结肠癌53例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期48例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化63例，中低分化27例。所有标本均经组织病理学检查证实为结直肠癌。

1.2 实验方法

1.2.1 实验仪器 SantaCruz公司生产的人重组PTN细胞因子、PTN 单克隆抗体以及PTN多克隆抗体；西安沃尔森生物科技有限公司生产的原位杂交试剂盒、碱性磷酸酯酶显色试剂盒、免疫组化试剂盒及无水乙醇；上海生工生物工程有限公司制造的PTN探针；浙江临安电子器材厂制造的YWY781型医用微波仪；德国Leica光学显微镜。

1.2.2 PTN mRNA检测 原位杂交法：（1）二甲苯脱蜡处理石蜡切片，1 g/L蛋白酶K作用15 min；双蒸水洗1 min后用无水乙醇洗2 min，吹干。（2）预杂交：预杂交液（50 μL）滴加在切片上，置于42 ℃恒温箱孵育30 min，去除预杂交液。（3）杂交：杂交液（20 μL）滴加在切片上，硅化盖玻片盖好后放置在37 ℃湿暗盒中24 h。（4）免疫检测：0.5 mL Buffer1清洗2 min后，滴加30 μL浓度为0.1 mol/L中性盐溶液和10%聚乙二醇辛基苯基醚，再滴加1.0 mL Buffer1，室温孵育30 min，滴加15 μL浓度为0.1 mol/L的NSS和45μL 10% TritonX-100，滴加Buffer1到1.5 mL，同时滴加50 μL抗地高辛抗体，室温下孵育2 h；Buffer1清洗2次后Buffer3清洗，光学显微镜下，在暗盒内监控显色反应程度，细胞浆染色与细胞外背景表现为明显差异时用Buffer4终止反应；（5）核固红衬染5 min，脱水后以中性树胶封片。PTN 探针序列：地高辛标记3′端，锁核酸修饰中部“（T）”的碱基。阴性对照使用PBS替代杂交液。

1.2.3 PTN蛋白检测 免疫组化染色法：参照文献[5]采用微波-EliVision TM法进行操作。阳性对照为PTN蛋白阳性表达的直肠癌组织，阴性对照为PBS代替一抗。

1.3 评价标准 参照文献[5]对原位杂交及免疫组化染色结果进行评价。（1）PTN探针杂交阳性：细胞质和细胞核中发现浅蓝色至深蓝色颗粒。每张切片随机选择5个高倍视野进行测定平均阳性反应面积。阴性：阳性面积≤20%；阳性：阳性面积＞20%。（2）免疫组化染色阳性：细胞浆内发现浅棕至深棕色颗粒。随机选取5个高倍视野，计算平均阳性染色细胞率。阴性：阳性染色细胞率＜5%；弱阳性：阳性染色细胞率5%～25%；阳性：阳性染色细胞率25%～50%；强阳性：阳性染色细胞率＞50%。（3）染色强度计分：不着色：1分，淡黄色：2分，浅棕色：3分，深棕色：4分。两种计分相乘后，乘积值依次对应0、2、6及12分，0和2为阴性，6和12为阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料应用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTN mRNA及其蛋白表达结果 两组组织芯片均能够发现PTN mRNA表达（图1、图2）。PTN mRNA在正常结直肠组织中主要在黏膜上皮细胞表达，而结直肠癌组织中，主要在肿瘤细胞细胞质，呈弥漫性或灶性分布。PTN蛋白在正常结直肠组织中在正常腺体细胞的细胞浆进行表达（图3）；而在结直肠癌组织中，不仅表达于结直肠癌细胞，在血管内皮细胞中也可表达（图4）。

图1 结直肠癌组织PTN mRNA表达

图2 正常结直肠组织PTN mRNA表达

图3 结直肠癌组织PTN蛋白表达

图4 正常结直肠组织PTN蛋白表达

2.2 两组PTN mRNA及其蛋白阳性表达率比较 实验组PTN mRNA阳性表达率为62.2%，PTN蛋白阳性表达率为58.9%，对照组分别为41.4%、34.3%，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 PTN mRNA及蛋白表达与临床病理的关系 通过观察结直肠癌组织中PTN mRNA及其蛋白的表达情况，结果表明，年龄、性别及肿瘤类型对PTN mRNA及其蛋白无显著影响（P＞0.05）；而TNM分期、分化程度与PTN mRNA及其蛋白阳性表达率有显著关系（P＜0.05），见表2。

表1 两组PTN mRNA及其蛋白阳性表达率比较 例（%）

表2 PTN mRNA及蛋白表达与临床病理的关系

3 讨论

结直肠癌是临床高发恶性肿瘤之一，目前手术治疗是其主要的治疗方法，但治疗效果较差。TNM分期及肿瘤分化是临床上预测结直肠癌预后的主要依据，也是进行放化疗的主要参考指标。PTN基因主要分布在7q33～q34，其长度超过100 kb，由5个外显子和1个非翻译的外显子组成，PTN编码氨基酸的蛋白质共有168个，其中包含信号肽（32个氨基酸共同组成），PTN基因种属不同呈现出高度保守的特点，PTN是已知的生长因子中最保守的基因之一[4，6]。研究发现，PTN与肿瘤的发生发展具有密切关系，能够为肿瘤预后提供参考依据[7-9]。本实验结果显示，与正常结直肠组织相比较，结直肠癌组织的PTN mRNA阳性表达率和PTN蛋白阳性表达率显著升高（P＜0.05）；TNM分期不同、分化程度不同，PTN mRNA及其蛋白阳性表达存在显著性，即分期越晚，分化程度越高，PTN mRNA及其蛋白阳性表达率越高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PTN是分泌性生长、分化因子，与肝素具有高度亲和作用，能够促进血管生成、改善神经系统及骨发育情况，增强细胞增殖与迁移，在肿瘤患者中，PTN能够对V-sis原癌基因转化细胞、子宫细胞DNA合成、内皮细胞和成纤维细胞有丝分裂起促进作用[9]。

目前有研究利用流式细胞术证实PTN显性失活，神经胶质瘤细胞恶性表型能够逆转，细胞周期减慢，提示PTN对染色体分离及细胞周期具有重要调控作用。也有研究发现大脑室管膜下层处于发育中的神经胶质母细胞及室管膜细胞可检测到PTN mRNA，提示PTN对大脑神经、血管具有重要作用[9-10]。

综上所述，PTN与结直肠癌的恶化程度具有密切关系，监测结直肠癌患者PTN表达有利于正确判定结直肠癌患者预后。

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The Expression and Clinical Significance of Pleiotrophin （PTN） mRNA and Its Protein in Colorectal Carcinoma/

DONG Zi-long，WU Yan-ting，ZHANG Sheng-bin.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：008-010

Objective：To discuss the expression and clinical significance of pleiotrophin （PTN） mRNA and its protein in colorectal carcinoma tissues.Method：90 cases of colorectal carcinoma（the exprimental group）and 70 cases of normal colorectal tissues（the control groups）were selected. The situ hybridization and immunohistochemical staining methods were used to detect PTN mRNA and protein expression in the two groups. 90 cases of primary colorectal carcinoma who under surgical treatment were selected，and the relationsnip of PTN mRNA and protein expression with chinical pathological characteristics of the colorectal cancer patients were analyzed.Result：In the experimental group， PTN mRNA positive expression rate was 62.2%， PTN protein positive expression rate was 58.9%， there was a statistically significant difference when compared with the control group （P＜0.05）. There were no significant differences in PTN mRNA and protein expression for different ages， genders and cancer types （P＞0.05）. There were significant differences in PTN mRNA and protein expression for different TNM staging and different degree of differentiation （P＜0.05）.Conclusion：PTN mRNA and protein is closely related to tumor stage and degree of differentiation， it can be used as the reference for judging prognosis ofcolorectal carcinoma.

Pleiotrophin； PTN protein； Colorectal carcinoma tissues

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.08.004

2014-01-16） （本文编辑：蔡元元）

①内蒙古医科大学第三附属医院 内蒙古 包头 014010

董子龙

First-author’s address： The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China