不同颜色类群芒果的ISSR分析

张 宇，唐志鹏 ，高 兴，杨培丽，范琪祺，黄国弟

（1.广西大学 农学院，广西 南宁 530004； 2.广西壮族自治区 亚热带作物研究所，广西 南宁 530002）

亚洲国家的消费者习惯上喜欢果皮呈淡黄色的芒果，而欧美各国的消费者则喜欢果皮呈红色或粉红色的芒果。随着我国芒果种植业的发展，芒果品种逐渐丰富，国内消费者对外观艳丽的红芒开始感兴趣。因此，选育出果实外观艳丽的芒果品种是今后开展新品种选育的发展方向之一[1]。根据形态学特征和果皮颜色，可将芒果分为红芒品种群、金芒品种群、青芒品种群[2]。红象牙（红色果皮）是从象牙芒（青黄色果皮）实生后代中选育出来的，两者的相似系数高达0.933，是研究果皮颜色相关的连锁标记较理想的试材[3]。通过芒果种质遗传多样性的RAPD分析发现，1条约550 bp的特异性谱带在16个供试的红色果皮芒果品种中有15个缺失此带，推测这一谱带可能是与果皮颜色相关联的标记[3-4]。芒果的果色表达可能受主效基因控制，果皮出现红色可能是因为缺失了与某颜色有关的基因，这与苹果果皮的颜色由单基因控制红色显性性状类似[5]。红色果皮的芒果起源于印度单胚种群，而黄色果皮的芒果起源于印度支那多胚种群[6-7]。国内外对芒果果皮颜色性状遗传机理的研究较其它植物少[1]，同时未见借助ISSR（Inter simple sequence repeat）标记来选育不同果皮颜色芒果品种的报道。若将ISSR标记技术用于芒果果皮颜色资源评价，可加快芒果果色遗传研究和遗传改良的进程[8]。文中以芒果市场和芒果生产发展的需要为原则，利用ISSR标记法[9-15]，对不同颜色类群的芒果进行了遗传多样性分析，旨在为今后开展芒果定向育种研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的8个芒果品种全部采集自广西大学标本园，各芒果品种的基本情况如表1所示。

表1 供试遗传多样性分析的不同颜色类群的芒果品种情况Table 1 Status of mango cultivars with different colors peels used for genetic diversity analysis

1.2 方 法

采集上述8个芒果品种的10片嫩红且长势良好的叶片作为试材，装入塑料袋封口后置于有冰块的冰壶中，立即带回实验室，用蒸馏水清洗后用滤纸吸干表面水分，保存于－25℃冰箱中备用[16-17]。称取0.5 g叶片，用液氮研磨至粉末状，采用张宇等的改良CTAB法提取每个样本的总DNA[18]。PCR扩增及检测参考张宇等[18]的方法进行反应体系的优化，所得PCR总反应体系20.0 μL，其中：ddH2O 15.9 μL、模板 1.0 μL、5 U/μL Taq酶（含 Mg2+）0.2 μL、10 mmol/L 引物 0.4 μL、碱基 0.5 μL、10×Buffer 2.0 μL；PCR 扩增程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃ 1 min，48～ 51 ℃退火50 s（温度不同引物的退火温度不同），72 ℃1 min，进行40个循环引物；72 ℃延伸8 min，在4 ℃保存。扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测、拍照。选择加拿大哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）公布的引物，进行序列设计与合成，引物浓度一般为0.2 μmol/L。利用NTsys2.10软件进行聚类分析研究，在凝胶电泳中，按扩增条带的有无记数，当出现某一扩增带时，赋值为“1”，不存在时赋值为“0”。在Excel表中将相对分子质量数值转化为1、0矩阵，再用NTsys2.10软件深入分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物筛选

以台农1号、金煌芒、金穗芒、桂热82号、四季蜜芒、爱文芒、凯特芒、红芒6号等8个芒果品种为模板，选择5条适合不同颜色类群芒果的遗传多样性分析的ISSR引物，如表2所示。

表2 不同颜色类群的遗传多样性分析引物的序列和退火温度†Table 2 Primer sequences and annealing temperatures in genetic diversity analysis of different color groups

2.2 多样性表现

分别将引物UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890用于不同颜色类群芒果的遗传多样性分析，引物UBC-864可将8个供试芒果品种分为两类：台农1号、金穗芒、金煌芒、桂热82、四季蜜芒这5者之间的亲缘关系较近；凯特芒、爱文芒、红芒6号与上述5个芒果品种的亲缘关系较远。

UBC-864对8个芒果品种PCR扩增的电泳图谱如图1所示。从图1可看出：凯特芒、爱文芒、红芒6号在大小约750 bp和2 000 bp位置处有清晰的同源性谱带，而台农1号、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂热82号在此处无同源性谱带；台农1号、金穗芒、四季蜜芒、桂热82号在约1 100 bp位置处有明显的同源性谱带，而金穗芒在此处无同源性谱带，推测金穗芒较其它4个供试芒果品种的亲缘关系较远。

图1 UBC-864对8个芒果品种PRC扩增的电泳图Fig. 1 Electrophorogram of PCR amplified production of eight mango cultivars by UBC-864 primer

2.3 多态性表现

利用5条扩增稳定、清晰、多态性好的ISSR引物，对供试的8个芒果品种进行扩增，结果如表3所示。5条随机引物共扩增出51条谱带，其中多态性谱带41条，多态率在76.9%～87.5%之间，平均多态率达80.4%，每一个随机引物产生9～13条谱带。

表3 ISSR引物和多态性分析Table 3 ISSR primers and polymorphic analysis

UBC-857对8个芒果品种PCR扩增的电泳图如图2所示。UBC-857扩增谱带的大小分布在400～3 200 bp，集中分布在600～1 031 bp。8个供试品种共产生位点数58个，多态位点数55个，平均位点数7.25个。台农1号、金穗芒、金煌芒扩增出较多的谱带，四季蜜芒与桂热芒82号相对扩增谱带较少，8个供试芒果品种的遗传差异较大。

2.4 聚类分析

图2 UBC-857对8个芒果品种PCR扩增的电泳图Fig. 2 Electrophorogram of PCR amplified production of eight mango cultivars by UBC-857 primer

图3 8个芒果品种的ISSR聚类分析树状图Fig. 3 Dendrogram of eight mango cultivars by ISRR cluster analysis

对在重复实验中能稳定出现的差异性谱带进行了分析，用NTsys2.10软件进行谱带统计，用UPGMA法构建了品种之间的分子系统树状图。最终选定UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890共5条扩增稳定、清晰、多态性强的引物对供试的8个芒果品种进行ISSR-PCR分析，如图3所示。结果显示，供试的8个芒果品种间的相似系数变化范围为0.43～0.92。以0.52作为相似系数的分界点，可把8个芒果品种分为2大类，第1类包括台农1号、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒和桂热82；第2类包括凯特芒、爱文芒和红芒6号；以0.78作为相似系数的分界点，2个大类又可各自分为2个小类，共4个小类。其中红芒6号有别于爱文芒、凯特芒单独为1类；金穗芒有别于台农1号、金煌芒、四季蜜芒、桂热82单独为1类。依据传统的形态学分类法，以果实的果皮颜色为第一特征分类，芒果可分为红芒品种群、金芒品种群、青芒品种群[2]。ISSR聚类分析的结果与传统的形态学分类法比较吻合，说明ISSR分子标记具有较强的可靠性。

3 结论与讨论

表观遗传在植物适应环境变化的过程中起到了重要作用。表观遗传机理是非常复杂的。植物可以通过表观遗传来调控基因表达、对转基因进行修饰、建立新的等位基因、调控基因组重排和转座子活性、改变基因组DNA序列的进化速率来适应环境压力[19]。当植物遇到环境压力时，表观遗传的修饰程度会发生改变。这种改变一部分是可以遗传的，一部分会因为压力的去除而在同一代细胞中发生回复[20]。目前，植物中的表观遗传研究相对于动物来说是比较少的，研究对象也主要集中在拟南芥[21-22]、水稻[23]等模式植物上，而文中选择以目前研究较少的芒果为试材，采用ISSR标记、运用NTsys软件对多个芒果品种进行了遗传多样性分析。引物UBC-840、UBC-857、UBC-864、UBC-868、UBC-890可用于芒果不同颜色类群的遗传多样性分析，扩增多态率达80.4%，供试材料之间存在着丰富的遗传多样性。UBC-864将8个供试品种分为2类：凯特芒、爱文芒、红芒6号在约750 bp和2 000 bp处有同源性谱带，台农1号、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂热82在此处无谱带；台农1号、金穗芒、四季蜜芒、桂热82在约1 100 bp处有同源性谱带，而金穗芒在此处同源性谱带模糊暗淡，推测金穗芒较其它4个供试芒果品种的亲缘关系较远。供试芒果品种间的相似系数范围为0.43～0.92。以0.52作为相似系数的分界点，可把8个芒果品种分成2大类。以0.78作为相似系数的分界点，这2大类又可分为4小类。红芒6号有别于爱文芒和凯特芒而单独分为一类，金穗芒有别于台农1号、金煌芒、四季蜜芒和桂热82而单独分为一类。2大类中，台农1号、金穗芒、金煌芒、四季蜜芒、桂热82号属于青色品种群；凯特芒、爱文芒、红芒6号属于红色品种群。按照果皮颜色为第一特征的形态学分类，芒果分为红色品种群、金色品种群和青色品种群[2]。ISSR聚类分析与形态学分类结果表现一致。当然，文中选用的试材只有8个芒果品种，不能代表全部芒果果皮颜色的所有遗传信息，且没有顺利完成对特异性谱带的回收测序。因此，要从分子生物学的角度寻找与芒果果皮颜色性状相关的遗传序列，还需要进一步开展更深入的研究。

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