黑花生衣中黄酮类物质的提取方法研究

陆文蔚，黄玥

（上海商学院食品系，上海200234）

黑花生衣中黄酮类物质的提取方法研究

陆文蔚，黄玥

（上海商学院食品系，上海200234）

研究超声波辅助提取黑花生衣中黄酮类化合物的工艺条件，探讨乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、pH对提取效果的影响。确定影响黄酮提取效果的最主要因素是料液比，并得出黑花生衣中黄酮类化合物在超声波频率为50 kHz条件下提取的最佳工艺条件为：提取溶剂为60％乙醇，提取时间45min，提取温度40℃，料液比1∶300（g/mL），pH2.5。在此基础上，通过测定黑花生衣提取液对活性自由基的清除作用，探讨其抗氧化活性。结果表明，黑花生衣中黄酮类化合物对羟基自由基（·OH）、和DPPH·自由基皆具有显著的清除作用，且其清除作用与浓度之间呈量效关系。

黑花生衣；黄酮类化合物；超声波；抗氧化

黑花生衣色素是从黑花生内衣提取的一类色素，花生衣色素主要成分为黄酮类化合物，含有花色苷、黄酮、二氢黄酮等。研究发现，黑花生与普通的红衣花生相比，前者种衣中含有较高含量的花色苷，且其色泽深，容易提取，因此，黑花生衣色素在保健食品及医疗食品等方面具有广阔的开发前景[1-3]。国外对黑花生衣的研究非常少，对类似的黄酮类化合物等的研究主要集中在营养作用的分子机理，因此在黑花生衣中黄酮类化合物的许多方面还缺乏研究数据[4-7]。

乙醇对于极性大的花色苷色素的提取是优良的提取溶剂[3]。超声波具有减少溶剂耗量、缩短萃取时间的特点，并且在不破坏有效成分和较低的温度下就能实现高效率的提取。在此基础上，本文对黑花生衣中黄酮类化合物在超声波条件下进行提取条件的优化，并初步研究其抗氧化活性，为黑花生衣色素的研究及利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑花生（市售）；硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、无水乙醇、蒸馏水、Tris-HCl溶液、盐酸、没食子酸、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、DPPH、芦丁：（国药集团化学试剂有限公司），均为分析纯。

756CRT紫外可见分光光度计：上海精密仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；KQ2200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海鲁伊工贸有限公司；SHZ-D循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 黑花生衣色素黄酮类化合物的提取流程

黑花生仁→真空干燥→剥取花生衣→粉碎（过40目筛）→乙醇溶液浸提→离心（4 000 r/min）→取上清液→备用

1.2.2 提取条件的确定

1.2.2.1 单因素对提取效果的影响

提取条件的研究主要考虑以下5个因素：乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、pH。

1.2.2.2 正交试验确定最佳提取条件

鉴于乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度、pH对黑花生衣色素中黄酮的提取均有一定的影响，通过L18（37）正交试验确定最佳提取条件，试验水平如表1所示。

表1 试验因素水平Table1 The levels of orthogonal test

1.2.3 芦丁法测定测定黑花生衣中总黄酮的含量

准确称取标准品芦丁55.45mg，以60％的乙醇定容至50mL，取10mL以30％的乙醇定容至50mL，作为芦丁标准溶液备用；称取2.5 gNaNO2，以去离子水定容至50 mL，作为5％NaNO2溶液备用。称取5.0 g Al（NO3）3，以去离子水定容至50mL，作为10％Al（NO3）3溶液备用。

分别吸取上述配置好的芦丁母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于具塞试管中，以30％乙醇定容至10mL，加入5％NaNO2溶液1.0mL，摇匀静置60min，然后加入10％Al（NO3）3溶液1.0mL，以去离子水定容至25mL，混合均匀，静置15min，在510 nm下测定吸光度值，并绘制标准曲线[8]。

称取样品粉碎的黑花生衣0.019 4 g，以30％乙醇定容至10mL，按照制作芦丁标准溶液的标准曲线方法进行测定，对照标准曲线，计算总黄酮的含量。

1.2.4 黑花生衣黄酮类化合物抗氧化能力的测定

1.2.4.1 清除羟自由基能力的测定

Fenton反应产生的羟自由基能与水杨酸生成羟基化产物2，3-二羟基苯甲酸，用比色法测定其含量能间接测定羟自由基的生成量。

准确称取1.0 g经粉碎的黑花生衣，在最佳提取条件下进行提取，离心，取上清液。按照比例配置成浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的黑花生衣提取液。依次向各试管中加入上述各提取液1.00 mL，FeSO4溶液（1.8mmol/mL）2.00mL，水杨酸–乙醇（1.8mmol/mL）1.50mL，最后加H2O2（体积分数为0.03％）0.10mL启动反应，振荡试管，混合溶液，水浴37℃，保温30min，然后在波长510 nm下测量各浓度的吸光度值As。同时在相同条件下做空白试验，所测得吸光值记为A0。根据公式D=[（A0-AS）/A0]×100％计算清除能力，并绘制清除率（D）与样品浓度曲线[9-10]。

1.2.4.2 清除DPPH自由基效能力的测定

同1.2.4.1，将提取液配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL浓度溶液，分别吸取样液2.0mL，加入DPPH·乙醇溶液（2.0mg/mL）2.0mL，振荡混均，25℃水浴30min，以无水乙醇为对照，520 nm处测定试液的吸光度A1。同时，取2.0mL待测样液与2.0mL无水乙醇进行混合，以无水乙醇为对照，在520 nm处测定试液的吸光度A2。将2.0mLDPPH·乙醇溶液与2.0mL无水乙醇混合，同样以无水乙醇为对照，于520 nm处测定试液的吸光度A3。每组测定3次，求取平均值。根据公式D=[1-（A1-A2）/A3]×100计算样品的清除能力，并绘制清除率（D）与样品浓度曲线。

2 结果与分析

2.1 黑花生衣提取液最大吸收波长的测定

通过扫描，黑花生衣提取液在520 nm处有最大吸收，属于黄酮类化合物的特征吸收峰，见图1。

图1 最大吸收峰的扫描图谱Fig.1 The curve of wavelength-absorbance

研究表明花色苷的最大吸收区在500 nm～550 nm，由此可以推测，在黑花生衣黄酮类化合物中，花色苷是主要成分之一。此后试验中以520 nm处的吸光度值来衡量提取效果的差异。

2.2 单因素对提取效果的影响

2.2.1 不同乙醇浓度对提取效果的影响

乙醇水溶液提取过程中控制体系的提取温度50℃、料液比1∶500（g/mL）、提取时间1h、pH为2.0，提取次数1次。设置20％、40％、60％、80％、100％（体积百分比）的乙醇溶液对黑花生衣粉末进行提取，研究不同乙醇浓度对黑花生衣色素提取率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对提取效果的影响（520 nm）Fig.2 Effect of concentration on extraction（520 nm）

由图2可知，在乙醇浓度20％～60％的范围内，随着乙醇浓度的升高，吸光度也随着增加。在此之后，随着乙醇浓度的升高，吸光度随之减小，当乙醇浓度达到80％时，吸光值变小且趋于平稳。

2.2.2 料液比对提取效果的影响

提取过程中控制体系的提取温度50℃、乙醇体积分数60％、提取时间1 h、pH2.0、提取次数1次。研究不同提取料液比对提取率的影响，结果见图3。

图3 料液比对提取效率的影响（520 nm）Fig.3 Effect of material ratio and solvent on extraction（520 nm）

随着料液比的增大，吸光度的变化量也在逐渐减少，在料液比为1∶500（g/mL）以后，吸光度的变化量基本趋于稳定，无明显的变化，为得到较大提取率，并且节约成本，选取1∶300（g/mL）比较合适。

2.2.3 温度对提取效果的影响

提取过程中控制体系的乙醇体积分数60％、提取时间1 h、料液比为1∶500（g/mL）、pH为2.0提取次数1次。考查不同温度对黑花生衣色素提取率的影响，见图4。

图4 提取温度对提取效果的影响（520 nm）Fig.4 Effect of temperature on extraction（520 nm）

从30℃～50℃的温度范围内，随着温度的升高，吸光值逐渐减小，当温度达到60℃时，吸光度上升。当温度继续升高，则吸光度出现下降趋势。这可能与花色苷热不稳定发生降解有关。

2.2.4 提取时间对提取效果的影响

提取过程中控制体系的乙醇浓度为60％、提取温度50℃、料液比1∶500（g/mL）、pH为2.0、提取次数为1次，研究不同提取时间对黑花生衣色素提取率的影响，见图5。

图5 提取时间对提取效果的影响（520 nm）Fig.5 Effect of time on extraction（520 nm）

由图5可知，随着提取时间的增加，吸光度增大，在提取时间45min时达到最高，以后又趋于下降。这表明，提取时间与色素变化密切相关，时间过短，可能提取还不够充分，所以吸光度不大；但时间过长，又可能引起花色苷等化合物结构的变化进而使吸光度降低。

2.2.5 pH对提取效果的影响

提取过程中控制体系的乙醇体积分数60％、提取时间1 h、料液比为1∶500（g/mL）、温度50℃，提取次数1次，研究不同pH对黑花生衣色素提取率的影响，见图6。

图6 pH对黑花生衣色素提取率的影响（520 nm）Fig.6 Effect of pH on extraction（520 nm）

表2 正交实验结果Table2 The results orthogonal test

由图6可知，pH在较小的值时吸光度比较大。pH越小，提取越充分，提取率越高。pH降低到1.5时，吸光度开始下降，可能与花色苷在强酸条件下不稳定有关。

2.3 最佳提取工艺的确定

按表1所示的试验水平进行L18（37）正交试验，结果如表2所示。

由表2可知，影响黑花生衣黄酮提取效果的因素的主次顺序为B＞A＞D＞E＞C，即料液比＞乙醇浓度＞浸提温度＞pH＞提取时间。其最优组合是A2B1C1D1E2。

做验证性试验，测得由该组条件所得的提取液的吸光度值为0.712，符合上述结论。因此可确定在频率为50 kHz的超声波提取条件下，黑花生衣黄酮类化合物的最佳提取工艺条件：乙醇浓度60％，料液比1∶300（g/mL），提取时间45min，提取温度40℃，pH为2.5。

2.4 黑花生衣中总黄酮的含量

根据芦丁标准溶液的标准曲线，见图7，黑花生衣提取液中总黄酮的含量为74.7mg/g。

图7 芦丁标准品工作曲线Fig.7 Working curve of rutin

2.5 黑花生衣黄酮类化合物清除羟自由基的效果

黑花生衣黄酮类提取液对羟自由基的清除效果见图8。

图8 黑花生衣提取液清除羟自由基的效果Fig.8 Elimination of extraction on·OH

由图8可知，黑花生衣提取液对于羟自由基的清除效果均随着浓度的增大而增强。计算可知，IC50为0.18mg/mL。

2.6 黑花生衣黄酮类化合物清除DPPH自由基的效果

黑花生衣黄酮类提取液对DPPH自由基的清除效果见图9。

图9 黑花生衣提取液清除羟自由基的效果Fig.9 Elimination of extraction on·OH

由图9可知，黑花生衣提取液对于DPPH自由基的清除效果均随着浓度的增大而增强。计算可知IC50为0.035mg/mL。

3 结论

实验结果表明，黑花生衣黄酮类化合物具有较强的清除自由基的功能，据相关研究表明黑花生衣色素中黄酮类化合物是自然界中最大的一类水溶性天然色素[8]，特别是花色苷具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、降低低密度脂蛋白等多重功能。在本文基础上，研究将进一步探讨黄酮类化合物中花色苷等组分的分离、提取纯化条件，进一步掌握抗氧化功能因子的含量及组成。

黑花生衣色素是一种具有抗氧化活性的天然色素，不仅可用于食品的着色，而且可以起到保健作用[11]，对其研究具有现实意义。本文采用超声波辅助提取，乙醇水溶液作为提取剂可以最大程度保持黄酮类化合物的活性，提高提取效率，并且降低成本。该方法操作容易，而且也易于工业化。不仅能够得到较多的黄酮类化合物，也为黑花生进行保健食品开发、功能因子提取等研究提供方法和参考。

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Study on Extraction of Flavonoid Com pounds from Blank Peanut Skin Pigment

LU Wen-wei，HUANG Yue
（The Department of Food Science，Shanghai Business School，Shanghai200234，China）

Ultrasound-assisted extraction of flavonoid compounds from black peanut skin was studied in this paper，and we discussed the effect of the solvent concentration，extraction time，extraction temperature，ratio of solid and liquid and pH．The results showed that the most important factor was the ratio of solid and liquid．The optimum conditionswere determined as：ultrasonic（50 kHz），60％ethanol，extraction time 45min，extraction temperature40℃，the ratio of solid and liquid 1∶300（g/mL）and pH 2.5．This paper also studied on the scavenging activity of the flavonoid compounds on the free radicals．The result showed that the flavonoid compounds can remove hydroxyl radicals and DPPH·，and the antioxidative activities increased with the increasing of the concentration．

Black peanut skin；flavonoid compounds；ultrasonic；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.011

2013-12-05

上海商学院重点课程建设项目；上海商学院科研项目（A-0201-00-050-105）

陆文蔚（1979—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品分析检测教学与科研工作。