金针菇多糖的抗氧化活性

黄琼，黄晓梅，张平，丁玲

（福建农业职业技术学院，福建福州350007）

金针菇多糖的抗氧化活性

黄琼，黄晓梅，张平，丁玲

（福建农业职业技术学院，福建福州350007）

以茶多酚和VC为对照，采用Fenton反应法研究金针菇多糖对羟自由基·OH的清除作用；采用邻苯三酚自氧化法研究金针菇多糖对超氧阴离子自由基O2-·的清除作用。结果表明：在本试验含量范围内，金针菇多糖对·OH和O2-·具有一定的清除能力；在含量相同的情况下，金针菇多糖对·OH和O2-·的清除能力比茶多酚和VC强。此外，研究了金针菇多糖抗油脂自动氧化能力，结果表明：金针菇多糖具有一定的抗油脂氧化活性。

金针菇多糖；抗氧化；·OH；O2-·

金针菇（Flammulina velutipes）富含蛋白质、碳水化合物、矿物质元素、维生素和粗纤维，含脂肪较低，是一种不可多得的高营养食品，有增智菇和“一休菇”等美称，在国际市场上的消费量仅仅次于蘑菇和香菇，目前已发展成为世界第三大食用菌[1]。金针菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharides，FVP）对人体具有多种保健功效：增强记忆力、抗疲劳、提高机体耐缺氧能力；抗肿瘤，抗白血病作用，干扰肿瘤细胞的有丝分裂过程和提高机体的免疫力；抗衰老，延长寿命；提高免疫功能；抗有害药物对机体的损害等[2]。

当人体内自由基产生过多或清除能力下降时，会导致各种严重病变，因此清除过量活性氧自由基具有重要意义[3]。寻找对自由基具有良好清除能力的清除剂，特别是从天然产物中寻找意义重大[4]。而多糖作为许多天然物的主要成分，具有低毒、安全、来源广，能提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从而起到保护生物膜的作用[5]。目前国内外关于金针菇多糖研究报道主要集中在金针菇多糖的提取，而对金针菇多糖的抗氧化性报道却很少。为此，本试验采用Fenton反应法、邻苯三酚自氧化法和油脂过氧化法，研究金针菇多糖对羟自由基·OH和超氧阴离子自由基O2-·的清除能力和对油脂的抗氧化能力，旨在为开发抗氧化、抗衰老的金针菇保健食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料

优质金针菇：福建农业职业技术学院食用菌基地提供，新鲜，菇型完整，无畸形、杂质、异味，呈白色。

1.1.2 试剂

苯酚、浓硫酸、无水乙醇、抗坏血酸（VC）、三羟甲基氨基甲烷、EDTA-Na2、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁均为分析纯；茶多酚购于无锡太阳绿宝科技有限公司，纯度为99％。

1.1.3 仪器设备

AB204-N/PL202-S型电子天平：梅特勒—托利多仪器（上海有限公司）；UV-2800型紫外可见分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；DHF-9055A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；LGR10-4.2高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52A旋转蒸发仪：上海天呈科技有限公司；数显恒温水浴锅：上海精密科学仪器有限公司；SHZ-D旋转水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金针菇多糖的提取

原料→烘干→称重→匀浆→热水抽提→离心分离→滤液醇析→复溶→去除杂蛋白→真空浓缩→干燥→产品

1.2.2 金针菇多糖对·OH的清除作用

利用Fenton体系[6]测定金针菇多糖对·OH-的清除作用。H2O2与2价铁离子混合后产生·OH，其反应方程式为：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+。·OH具有很高的反应活性，存活时间短，但在反应体系中加入邻二氮菲，能有效地捕捉·OH并产生有色产物。该产物在波长536 nm处有强吸收。若加入具有清除·OH功能的被测物，则会与邻二氮菲竞争·OH，从而使有色产物的生成量减少。采用固定反应时间法，在波长536 nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，测定被测物对·OH的清除作用。

取7支25mL比色管，分别加入7.5 mol/L邻二氮菲溶液1.0mL、pH 7.4PBS（0.1mol/L）缓冲溶液5.0mL，充分混匀后加入7.5mmol/L硫酸亚铁溶液1.0mL，立即混匀，然后，向其中5支试管中分别加入一定浓度的金针菇多糖、维生素C及茶多酚溶液作为样品，另2支比色管分别记为对照管和空白管，对照组以蒸馏水代替样品溶液和H2O2溶液，空白组以蒸馏水代替样品溶液。然后，在前5支比色管和空白比色管中分别加入浓度0.1％H2O21.0mL，再将7支比色管以蒸馏水补至25mL，使各待测液多糖浓度分别为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，于37℃下反应1 h，测定在波长536 nm处吸光度。“

·OH的清除率（E）的计算方法如下：

式中：A样品为金针菇多糖吸光值；A空白为空白组吸光值；A对照为对照组吸光值。

1.2.3 金针菇多糖对O2-·的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法[7]测定。在碱性条件（pH 8.2）下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成O2-·和有色中间产物。该有色物在波长325 nm处有一特征吸收峰。当加入O2-·清除剂时，O2-·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在波长325 nm处吸收峰减小。所以，通过测定在波长325nm处吸光值，可以计算多糖对O2-·的清除作用。

取5支10mL比色管，各加入0.1mol/LpH 8.2Tris-HCl缓冲液4.5mL，分别加入一定浓度的金针菇多糖、VC及茶多酚溶液作为样品，混合后置于25℃水浴中预热20 min，在25℃水浴中预热的7 mmol/L邻苯三酚0.3mL，以蒸馏水定容至10mL，使各待测液多糖浓度分别为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，混匀后于25℃水浴中反应，在第3min加入1滴10mol/LHCl终止反应，在波长325 nm处测定吸光度。清除率计算公式为：

式中：A自氧化为不加多糖的吸光值；A样品为多糖的吸光值。

1.2.4 金针菇多糖抗油脂自动氧化能力的测定

Fe2+/卵磷脂体系中，过渡金属离子如Fe2+等，可以通过多种途径促进油脂过氧化反应的进行。卵磷脂暴露在有氧环境中会发生自动氧化，实验时提高环境温度可以加速其氧化过程，通过测定其添加样品后的过氧化水平，并与空白对照比较，可以评价样品的抗油脂过氧化活性[8]。

取8mg/mL卵磷脂溶液0.2mL，分别加入一定浓度的金针菇多糖、VC及茶多酚溶液作为样品，加入50μL FeSO4（347.5mg FeSO4，35mg VC，定容至25mL）溶液，加0.1mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液（pH=7.4）定容至3mL，37℃恒温40min。然后，加入10mg/mL硫代巴比妥酸1mL（硫代巴比妥酸溶于10％三氯乙酸），摇匀，使样品液最终浓度分别为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL，在100℃水浴15min，4 000 r/min离心10min，于532 nm处测定吸光度，用蒸馏水代替样品做空白。

式中：A样品为样品的吸光值；A空白为空白管的吸光值。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次，数据取平均值，采用DPS数据处理软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 金针菇多糖对·OH的清除作用

按1.2.2的方法测定金针菇多糖、VC和茶多酚对·OH的清除作用，结果如图1所示。

图1 金针菇多糖、VC和茶多酚清除·OH的能力Fig.1 The ability of eliminating·OH of Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol

由图1可知，3种抗氧化剂对·OH均有一定的清除作用。其中金针菇多糖清除·OH能力最强，最高可达92.99％。茶多酚对·OH的清除能力与VC相当，金针菇多糖则大大高于前两者。金针菇多糖的清除·OH能力是VC的3.03倍，是茶多酚的3.93倍。从图1还可以看出：VC和茶多酚清除·OH能力随着浓度增加而提高，然而金针菇多糖清除·OH能力在含量较低时，随着含量的增加而提高；当含量超过0.001 0mg/mL时，抗氧化能力反而下降。这可能是由于含量越高，抗氧化剂对自身的抗氧化消耗越大，清除·OH的能力随之下降。

2.2 金针菇多糖对O2-·的清除作用

按1.2.3的方法测定金针菇多糖、VC和茶多酚对O2-·的清除作用，结果如图2所示。

图2 金针菇多糖、VC和茶多酚清除O2-·的能力Fig.2 The ability of eliminating O2-·of lotus Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol

由图2可知，3种抗氧化剂对O2-·均有一定的清除作用。其中金针菇多糖清除O2-·能力最强，最高可达24.58％。茶多酚对O2-·的清除能力与VC相当，金针菇多糖则高于前两者。金针菇多糖的清除O2-·能力是VC的1.32倍，是茶多酚的1.25倍。从图2还可以看出：3种抗氧化剂清除O2-·能力随浓度增加而提高。3种抗氧化剂浓度达到0.012 5mg/mL时，再增加抗氧化剂浓度，清除率变化不大，说明用量已接近饱和。

2.3 金针菇多糖抗油脂自动氧化能力的测定

按1.2.4的方法测定金针菇多糖、VC和茶多酚抗油脂自动氧化能力，结果如图3所示。

图3 金针菇多糖、VC和茶多酚抗油脂自动氧化能力Fig.3 The effect of lotus Flammulina velutipes polysaccharides，VCand tea polyphenol on oil anti-oxidation

油脂的自动氧化是油脂和含油脂食品最主要的变质现象，由图3可知，3种抗氧化剂对油脂均有一定的清除作用。其中Vc清除油脂能力最强，最高可达16.85％，茶多酚最高为11.69％，金针菇多糖最高为11.20％，金针菇多糖对油脂的清除能力与茶多酚相当。3种抗氧化剂抑制油脂过氧化作用和浓度有较大关系，浓度较低时，增大浓度抗氧化能力增强，但当浓度达到0.012 5mg/mL时，再增加抗氧化剂浓度，抗氧化能力反而下降。

3 结论

1）现代医学和营养保健学认为，自由基在人体内可直接引起许多疾病，一些疾病的发生与自由基也相关。人们普遍认为植物天然抗氧化物可以抑制自由基反应，最终具有抗衰老、减少癌症、心血管疾病的发生[9-10]。金针菇多糖具有较好的清除氧自由基的能力，表明其能够清除人体内过剩的氧自由基，而氧自由基与机体衰老、疾病关系密切，说明金针菇多糖具有抗衰老作用、减少癌症、心血管疾病的发生。

2）金针菇多糖对·OH、O2-·的清除能力清除效果显著，均比VC和茶多酚强，且具有一定的抗油脂自动氧化能力。因此，说明金针菇多糖是较好的抗氧化剂。

3）当金针菇多糖含量超过一定量时，其清除自由基的能力随着含量的增加而下降，表明金针菇多糖作为一种较有效的天然抗氧化剂，使用时应当适量，否则有可能引起食品色泽的改变。

参考文献：

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Antioxidant Activity of Polysaccharides from Flammulina velutipes

HUANG Qiong，HUANG Xiao-mei，ZHANG Ping，DING Ling
（Fujian Vocational College of Agriculture，Fuzhou 350007，Fujian，China）

Using tea polyphenol and VCas the control，the effect of Flammulina velutipes polysaccharides on scavenging·OH and O2-·was studied with Fenton reaction and pyrogallol autoxidation methods．The results showed that Flammulina velutipes polysaccharides had certain ability to scavenge·OH and O2-·；with various concentrations．When concentrations were the same，Flammulina velutipes polysaccharides had stronger ability than tea polyphenol and VCto scavenge O2-·and·OH．In addition，the oil and oxidation of Flammulina velutipes polysaccharides was studied．The results showed that Flammulina v elutipes polysaccharides had certain ability on anti-oxidation of oil．

Flammulina velutipes polysaccharides；antioxidatio；·OH；O2-·

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.017

2012-09-29

福建省教育厅B类科技研究项目（JB12375）；福建农业职业技术学院级课题（11-2s-01）

黄琼（1976—），女（汉），讲师，硕士，主要从事天然产物开发与利用方面的科研与教学工作。