固体试剂比色法测定食品中过氧化氢的研究

金露，汪倩，虞选柯，郭应建，时新超，赵澎涛，黄光荣，*

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州310018；2.杭州天迈生物科技有限公司，浙江杭州310018）

固体试剂比色法测定食品中过氧化氢的研究

金露1，汪倩1，虞选柯1，郭应建1，时新超1，赵澎涛2，黄光荣1，*

（1.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州310018；2.杭州天迈生物科技有限公司，浙江杭州310018）

建立一种通过易于保存的固体试剂来快速测定食品中过氧化氢的分光光度法。以固体酸氨基磺酸代替硫酸提供酸性环境，以草酸钛钾代替二氧化钛提供钛离子，酸性条件下钛离子与过氧化氢反应形成稳定的橙色络合物，通过分光光度计比色测定过氧化氢的含量。优化后的测定条件为：波长为390 nm，氨基磺酸和草酸钛钾的用量分别为100mg和180mg，反应温度为25℃，反应时间10min。该方法在过氧化氢含量为1.0mg/L～5.0mg/L时与吸光度呈线性关系，标准曲线的相关系数R2=0.999 4，最低检出限为0.45mg/L，测定相对标准偏差小于3％，平均加标回收率为91.6％～106％。

固体试剂；快速测定；过氧化氢；分光光度法

过氧化氢（H2O2）溶液，俗称双氧水，为无色无味的液体，是一种强氧化剂，具有较好的杀菌和漂白作用，因此有着广泛的用途：如在医院用作杀菌消毒剂清洗伤口，工业中双氧水广泛用于造纸业、纺织业等。在食品行业中，过氧化氢曾主要用于食品包装、食品纤维等方面的消毒杀菌和作为加工助剂，在使用过程中会产生大量活泼的羟基自由基，具有极强的氧化性[1]。但是，研究表明，吸入过量H2O2可使人中毒，一定量的H2O2对人体黏膜具有强烈的刺激作用[2]；低浓度H2O2会抑制线粒体的功能，使其数量减少，活力降低，抗氧化能力减低，能量合成障碍；高浓度H2O2会使血小板凋亡，抗氧化能力升高[3]；H2O2造成H9c2心肌细胞氧化损伤和DNA损伤，随着其暴露剂量和时间的不同表现为凋亡和坏死[4]。因此，我国卫生部在2011年出台的《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB2760-2011）已经将H2O2排除在食品添加剂之外[5]，只能作为食品用消毒剂及其原料继续生产经营和使用。但是，H2O2在食品中的滥用情况还时有发生，部分食品加工厂为了食品增白，往往采用工业双氧水来处理食品，以提高产品的外观，达到以次充好的目的。因此，建立简便快速准确的检测方法对双氧水滥用现象的监管将具有重要意义。

目前，对过氧化氢的检测主要有碘量法、钛盐比色法、辣根过氧化物酶-DPD法和色谱法等[1，6-7]。碘量法操作繁琐，检测限较高，不适合快速检测。DPD法方法对低浓度过氧化氢的测定较准确，但辣根过氧化物酶价格较贵且不易保存、容易失活。色谱法操作较为繁琐、耗时长，也不适合于快速检测。钛盐比色法是基于过氧化氢在酸性溶液中，与钛离子生成稳定的橙色络合物—过钛酸，其吸光度与样品中过氧化氢含量在一定范围内成线性关系的原理[8]，简单易行，但是《食品中残留过氧化氢的测定方法》（GB/T23499-2009）中的钛盐比色法耗时较长、需要使用浓硫酸，因此也不适合于快速检测。因此，为了检测方便、实用、延长试剂的使用期，以适合于快速检测，本文对国标方法中的钛盐比色法进行改进，用固体酸氨基磺酸来提供酸性环境、用草酸钛钾代替二氧化钛，通过对最佳波长、试剂用量、反应温度及时间等的进一步探究，确定了分光光度法快速检测的最佳反应条件，并应用于实际样品检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

UV1000型紫外可见分光光度计、CT14RD型台式高速冷冻离心机：上海天美科技有限公司；JA2003型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；KQ-2200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；超级恒温水浴槽（HH-4数控恒温水浴锅）：国华电器有限公司。

1.1.2 试剂

使用分析纯及以上级别的化学试剂和蒸馏水；过氧化氢标准储备液：移取30％过氧化氢3.0mL，以去离子水定容至100mL，混匀，并按国标GB/T 23499-2009中的高锰酸钾滴定法对标准储备液进行滴定，求得浓度；再移取适量过氧化氢标准储备液，以蒸馏水稀释定容成5.0mg/L标准使用液，标准使用液当天配置。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

准确吸取50mL待测溶液，在水浴中恒温5min，加入一定量的固体氨基磺酸和草酸钛钾，溶解，恒温一定时间，以蒸馏水的试剂溶液为空白对照，用1 cm比色皿，于一定波长下测定溶液的吸光度。

1.2.2 样品预处理

选取市售的鱿鱼丝、猪发皮、银耳三种样品作为分析检测的对象。样品经过简单的剪碎处理后，称取2.00 g于烧杯中，加入约60mL去离子水溶解，超声波提取10min，转移到100mL容量瓶中，加入20％三氯乙酸25mL定容至刻度（三氯乙酸浓度为5％），静置片刻后，取上清液在8 000 r/min的条件下离心10min，再将上清液经抽滤后得到待测样液；以蒸馏水代替样品，提取步骤同样品处理，最后的上清液作为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 测定过程的参数优化

2.1.1 测定波长的选择

吸取5mg/L过氧化氢标准工作溶液50mL与去离子水50mL于两小烧杯中，经显色反应后在380 nm～ 450 nm波长范围内每隔5 nm波长测定一次吸光度，结果在390 nm处有最大吸收值（如图1所示），与文献报道过氧化氢与钛离子形成的复合物检测波长430 nm或410 nm[7，9]接近，选择测定波长为390 nm。

图1 钛离子-过氧化氢复合物在360 nm～430 nm范围的光谱图Fig.1 The spectrum of titanium-hydrogen peroxide complex at 360 nm-430 nm

2.1.2 氨基磺酸用量的确定

显色反应的酸度条件直接影响显色反应程度。在反应体系中加入氨基磺酸分别为50、100、150、200、250、300mg条件下，按1.2.1的实验方法，在390 nm处测定吸光度，结果如图2所示。

该结果表明，在体系中加入100mg时，体系的吸光度最大，故采用100mg的氨基磺酸。

2.1.3 草酸钛钾用量的确定

图2 氨基磺酸加入量对吸光值的影响Fig.2 Effect of amino sulfur acid on absorbance

显色剂草酸钛钾的用量对测定体系吸光度的影响显著。在体系中分别加入草酸钛钾80mg～200mg，氨基磺酸加入量为2.1.2中确定的100mg，按1.2中实验方法在390 nm处测定溶液的吸光度结果，见图3。

图3 草酸钛钾的用量对吸光度的影响Fig.3 Effect of titanium potassium oxalate on absorbance

由图3可知，当草酸钛钾的用量在180mg时，测定体系的吸光度达到最大值，所以采用180mg草酸钛钾。

2.1.4 反应温度与时间的确定

不同的温度、不同时间下体系反应进行的程度可能是不同的。按照1.2.1实验方法，在以上得到的最适条件下，将恒温水浴温度分别设置成25、30、40℃，进行多组实验。并分别在10、15、20、25、30min时测定每组的吸光度，测定结果见图4。

图4反应温度和时间对吸光度的影响Fig.4 Effect of reaction temperature and time on absorbance

图4 表明，30min内同一水浴中的体系光度值变化很小，以及同一温度下，不同水浴的反应体系吸光值也很相近，由此可见，反应温度和时间对体系的影响很小，故选择温度为25℃（室温）、反应时间为10min。

2.2 标准工作曲线

分别配制1、2、3、4、5mg/L的过氧化氢标准溶液，按1.2.1实验方法，并在最佳的实验条件下进行反应，在390 nm下测定吸光值。结果表明，在1mg/L～5mg/L过氧化氢范围内，吸光值与过氧化氢溶液具有较好的线性关系（见图5），回归方程为y=0.029 2x-0.005，相关系数R2=0.999 4。

图5 固体试剂分光光度法测定过氧化氢的标准曲线图Fig.5 The standard curve of hydrogen peroxide determination by solid reagents spectrometric method

2.3 方法检出限

国际纯粹和应用化学联合会（IUPAC）对分析方法的检出限DL作如下规定[7]：

式中：K为根据一定置信水平确定的系数；Sb为空白多次测得信息的标准偏差；α为方法的灵敏度（即校准曲线的斜率）。

1975年，IUPAC建议对光谱化学分析法取K=3。由于低浓度水平的测量误差可能不遵从正态分布，且空白的测定次数有限，因而与K=3相应的置信水平大约为90％。

根据以上规定，本试验方法测定空白吸光度标准偏差为4.34×10-3（n=12），计算出的最低检出限DL= 0.45mg/L。由此可见，该法测定过氧化氢具有较高的灵敏度，且检出限较低。

2.4 方法精密度测定

配制了质量浓度分别为5mg/L过氧化氢标准溶液，平行测定8次，测定结果见表1。

表1 测定方法的精密度Table1 The precision of the provided test method

由表1可见，浓度为5mg/L的过氧化氢RSD为2.14％，小于5％，达到了分析的要求，且重现性好。

2.5 样品测定及回收率试验

移取一定量待测样液按试验方法1.2.1进行实验，以试剂空白作对照，每个样品重复测3次，并进行加标回收试验。得到结果，如表2所示。

表2 测定方法的加标回收率Table2 The recovery rate of the provide test method

从表2可见，本快速测定方法应用于3种实际样品中的过氧化氢测定的回收率为91.6％～106％，所以该方法适用于实际样品的检测。

3 结论

本文利用固体试剂代替国标食品中过氧化氢分光光度法测定中的硫酸与二氧化钛，测定食品中过氧化氢的含量。通过试验探究了测定的最佳条件，结果表明：反应体系的最大吸收波长为390nm，在50mL反应体系中加入100mg氨基磺酸提供酸性环境，180mg草酸钛钾作为显色剂，于25℃条件下反应10min后测定吸光值，可以准确地测定过氧化氢的含量。本方法准确可靠，重现性好，快速且简易，而且用固体试剂代替溶液具有保存方便、使用简单、便于携带等优点，可作为食品中过氧化氢快速测定的方法。

[1]陈易晖,刘艳,周建立,等.高效液相色谱-紫外检测法测定食品中的过氧化氢[J].光谱实验室,2009,26(2):414-416

[2]张耀亭,白世基,张维.改进的水中痕量过氧化氢的分光光度测定法[J].环境与健康,2006,23(3):258-261

[3]姚濛,武凤鸣,罗利,等.过氧化氢对大鼠血小板线粒体功能的影响[J].解剖学研究,2011,33(3):198-201

[4]冯星,孙磊,郭彩霞,等.过氧化氢致H9c2大鼠心肌细胞DNA损伤作用[J].中国公共卫生,2009,25(3):296-297

[5]中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2011:1-188

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T23499-2009《食品中残留过氧化氢的测定方法》[S].北京:中国标准出版社,2009:1-8

[7]张瑛洁,马军,张亮,等.钛盐分光光度法测定酸性染料体系中的过氧化氢[J].工业水处理,2008,28(11):72-74

[8]姜成春,庞素艳,马军,等.钛盐光度法测定Fenton氧化中的过氧化氢[J].中国给水排水,2006,22(4):88-91

[9]范华锋,张忠义,刘振林.分光光度法测定食品中过氧化氢[J].中国卫生检验杂志,2006,16(9):1079

Determination of Hydrogen Peroxide in Food by Spectrophotometric Method with Solid Reagents

JIN Lu1，WANG Qian1，YU Xuan-ke1，GUO Ying-jian1，SHI Xin-chao1，ZHAO Peng-tao2，HUANG Guang-rong1，*
（1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；2.Hangzhou Tianmai Biological Technology Co.，Ltd.，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

A kind of fast determination method of hydrogen peroxide in food by spectrophotometric with solid reagents was established in this paper.In this method，solid acid（amino sulfonic acid）was used to substitute for sulphuric acid to provide acid reaction condition and titanium potassium oxalate was used to substitute for titanium dioxide to provide titanium ion.The titanium ion was reacted with hydrogen peroxide under acid condition to form an orange complex and the color was determined by spectrophometric method to estimate hydrogen peroxide content.The optimum test conditions for hydrogen peroxide were determination wavelength of 390 nm，solid acid addition quantity of 100mg，titanium potassium oxalate addition quantity of 180mg，reaction temperature of 25℃and reaction time of10min.In this method，the hydrogen peroxide content within 1.0 to 5.0mg/L had linear relationship with absorbance，and the correlation coefficient of the standard curve（R2）was 0.999 4.The minimum detection limit of the provided method was 0.45mg/L，RSD was below 3％，and the average recovery rate of the sample was under 91.6％to106％.

solid reagents；fast determination；hydrogen peroxide；spectrophotometric method

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.020

2012-10-22

浙江省新苗人才计划项目（2012R409026）；杭州市科技计划项目（20110533B31）

金露（1991—），男（汉），本科，研究方向：食品安全快速检测。

*通信作者