TSA体外抑制人肺癌细胞系A549细胞增殖及机制

崔虎哲，王申桐，金铁峰，周宪春，元奎昌，张松男

(延边大学1.附属医院影像科;2.肿瘤研究所;3.附属医院科教处;4.附属医院心内科;5.附属医院肿瘤科，吉林延吉133000)

上皮-间质转化(pithelial-mesenchymal transition，EMT)是恶性肿瘤发生侵袭及转移的关键步骤，在肺癌的研究证实，EMT 与肺癌发生远处转移密切相关［1-2］。曲古抑菌素A(triehostatin A，TSA)是组蛋白去乙酰化酶(histonedeaeetylase，HDAC)抑制剂，可促进组蛋白的乙酰化水平、激活抑癌基因表达、抑制细胞增殖、引起细胞分化或凋亡［3］。有研究表明TSA 可以抑制肺癌细胞的增殖及迁移［4］，但其具体机制仍不清楚，尤其是TSA 调控EMT 在肺癌的研究未见报道。本研究旨在通过探明TSA 抑制A549 细胞的作用机制，为临床治疗肺癌提供新的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肺腺癌A549 细胞系和正常支气管上皮16HBE 细胞系(ATCC);胎牛血清、RPMI1640 培养基、胰蛋白酶和二甲基亚枫(DMSO)等化学试剂(北京华美公司);Western blot 实验相关试剂及MTT 试剂(武汉博士德生物有限公司);EMT 相关标志蛋白抗体(抗E-cadherin、抗Vimentin、抗Snail、抗GSK-3β 单克隆抗体)(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT 比色法检测细胞增殖能力:将A549 及16HBE 细胞系接种于含10%胎牛血清、5%青霉素/链霉素的RPMI1640 培养基中，37 ℃、5% CO2常规培养，0.25%胰蛋白酶消化并传代。取对数增殖期的A549 及16HBE 细胞以2 ×103个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入终浓度为0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L 的TSA，每种浓度设3 个平行复孔，对照组加入等体积的培养液。72 h 后加入50 μL/孔的MTT，4 h 后弃上清，加入200 μL/孔的DMSO，轻轻振荡数分钟，应用全波长多功能酶标仪，在570 nm 波长处测定其吸光度值，并按公式计算细胞生存率:细胞生存率(%)=实验组吸光值/对照组吸光值×100%。

1.2.3 划痕愈合实验检测细胞迁移与侵袭:将5 ×105个/mL 的A549 细胞接种于6 孔板中，每孔2 mL，培育24 h。待细胞完全贴壁，用10 μL 移液枪枪头在单层细胞上划一条直线，用PBS 清洗3 次。分别加入含曲古抑菌素A(TSA)的培养液及不含TSA 的培养液，于0、24 和48 h 观察并拍照。

1.2.4 Western blot 检测:A549 细胞经TSA 作用24 h;(浓度分别为0.1、1 和10 μmol/L)以PBS 洗2次后提取总蛋白;BrdaZford 法测定蛋白浓度;8%SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离;转至PVDF 膜上;室温下摇床封闭(TBSZT +5%脱脂奶粉)2 h;加入兔抗人E-cadherin、Snail、Vimentin、GSK-3β 和β-actin 的单克隆抗体;4 ℃过夜;室温下洗膜;加入辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG 二抗;孵育2 h;ECL 曝光;观察并拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS16.0 统计软件，所有数据以均数±标准差(±s)表示，以进行卡方检验。

2 结果

2.1 TSA 明显抑制A549 细胞增殖

1、10 和100 μmol/L 的TSA 培养细胞72 h 后，与未加药对照组相比，肺癌细胞A549 明显受到抑制(P＜0.01)。在100 μmol/L 时对16HBE 有明显抑制作用(P＜0.05)(图1)。

图1 TSA 对A549 细胞的增殖具有明显的抑制作用Fig 1 The TSA has obvious effect on A549 cells

2.2 TSA 对A549 细胞迁移能力的影响

当加入10 μmol/L 的TSA 后由于药物的作用使细胞的迁移受抑制，而对照组未加TSA 的细胞保持了原有的迁移能力在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(图2)。

2.3 TSA 对EMT 相关标志蛋白表达的影响

48 h 时与未加药对照组比较，在10 μmol/L 给药组其上皮细胞表型E-cadherin 蛋白表达显著上调(P＜0.01)，而间质表型Vimentin、Snail 及GSK-3β的表达均下调(P＜0.01)(图3，表1)。

3 讨论

研究证实，EMT 是转移发生的早期事件，有众多基因及信号通路参与到EMT 的调控过程当中［5-6］。EMT 除了促进癌细胞的侵袭性增加，还诱导癌细胞表现出干细胞样特点，如自我更新能力、增殖能力及抗拒凋亡的能力，并对化疗药物产生耐药等［7-8］。EMT 过程中上皮标志物E-cadherin、ZO-1等表达下调，而间质标志物N-cadherin、Snail、Vimentin 及GSK-3β 等表达上调，使肿瘤细胞脱离原发病灶，突破基底膜最终形成远隔转移［2］。最近，表观遗传学在肿瘤研究领域正成为新的热点。组蛋白乙酰乙酰基转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetyltransferases，HDACs)共同调控着真核细胞组蛋白乙酰化的水平，维持机体内环境的动态平衡。TSA 是研究得最为广泛的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。研究表明，TSA 可诱导P53 表达增高而诱导肺癌细胞的凋亡［9］，并且TSA 联合顺铂在体内及体外明显抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移［10］。有关组蛋白与EMT 的作用关系已有部分报道。研究证实，HDAC1 的过表达导致E-cadherin 启动子的活性减弱，而以转染shRNA 的方法下调HDAC1 的表达可有效抑制肿瘤细胞的转移，证实了HDAC1 与E-cadherin 的表达及EMT 的发生有关［11］。

图2 TSA 对A549 细胞迁移能力的影响Fig 2 The TSA significantly inhibited migration ability of A549 cells

表1 不同浓度TSA 作用于A549 细胞48 h 后相对蛋白表达变化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

表1 不同浓度TSA 作用于A549 细胞48 h 后相对蛋白表达变化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control groups．

groupE-cadherin/β-actinSnail/β-actinVimentin/β-actinGSK-3β/β-actin control0.181 ±0.0111.034 ±0.0130.641 ±0.0050.720 ±0.001 0.10.316 ±0.0470.485 ±0.0060.605 ±0.0240.532 ±0.008 1 0.289 ±0.0230.476 ±0.0420.687 ±0.0310.511 ±0.004 100.865 ±0.015＊＊0.147 ±0.005＊＊0.081 ±0.007＊＊0.552 ±0.012*

图3 TSA 对EMT 相关蛋白表达的影响Fig 3 EMT significantly inhibited by treatment of TSA

本研究发现TSA 对肺癌细胞系A549 的抑制作用较明显，而对16HBE 无明显抑制作用，说明TSA可针对性地抑制异常增殖的肿瘤细胞。划痕实验表明，TSA 对A549 细胞的侵袭及迁移具有明显的抑制作用，并且通过对EMT 相关蛋白的检测，提示TSA 抑制A549 细胞的迁移可能是通过抑制其EMT途径而实现的。

本研究结果证实，TSA 通过抑制EMT 途径抑制肺癌细胞的迁移，因此本研究对临床治疗肺癌提供了新的理论依据及实验基础。

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