利用城市粪便污水培养产油微藻的条件研究*

田 丹，桑力维，于 夕，Chung Wookjin，于景成

（1.北京昊业怡生科技有限公司，北京 100093；2.明知大学能源科学与技术系，韩国 449728）

粪便污水中COD、N、P浓度较高，粪便污水处理不同工艺阶段中，微藻生长所需的N、P和其他营养元素的含量呈现不同的浓度水平，为微藻提供了更多选择的培养基资源。因此，研究如何利用城市粪便污水培养产油微藻，实现粪便污水深度净化和产油微藻低成本大规模培养，达到净化水质的同时实现清洁能源生产的效果，对缓解能源短缺和环境污染问题具有重要的现实意义。笔者选择已报道的几种油脂含量较高的微藻，利用粪便污水驯化培养，从中筛选出能够适应城市粪便污水环境的产油微藻。开展了利用不同处理阶段的粪便污水培养产油微藻的条件研究，探讨粪便污水处理和产油微藻生产工艺的耦合的可行性。确定了利用粪便污水培养产油微藻的最佳条件和微藻培养对粪便污水的净化效果。为利用粪便污水大规模生产产油微藻，降低微藻生物柴油成本奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

1） 藻种：小球藻-1 （Chlorella vulgaris）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）购于中国科学院水生生物研究所藻种库，小球藻-2（Chlorella vulgarisAG10032）、四尾栅藻 （Scenedesmus guadricauda）由韩国明知大学提供。

2） 培养基：蒸馏水配制的BG11培养基［1］，取自粪便处理站不同处理阶段出水的污水培养基。其中UASB出水是指固液分离后的粪便污水经过升流式厌氧污泥床处理后的污水，MBR出水是UASB出水经过缺氧/好氧/膜生物反应器处理后的污水。粪便污水培养基经高压灭菌后使用。

3） 设备：DT5-1型低速自动平衡离心机、LRH-250型生化培养箱、752型紫外可见分光光度计、XSZ-H显微镜、VS型洁净实验台和RE-52CS型旋转蒸发器等。

1.2 方法

1.2.1 微藻培养

实验在温度可调恒温培养室中进行。采用锥形瓶作为藻种培养的反应器，锥形瓶用可透过空气的无菌封口膜包扎。以三基色荧光灯作为光源，光强的控制通过开启荧光灯的数量确定。微藻培养的初始吸光度0.1左右，每天摇动3次通入空气补充CO2。

1.2.2 微藻藻种的驯化

用蒸馏水稀释5倍的UASB出水与BG11标准培养基1∶1混合，作为藻种的初始驯化培养基，以BG11标准培养基作为对照。分别向250 mL锥形瓶中装入100 mL培养基，再接入微藻。培养温度25℃，光照强度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h。实验过程中每2 d取样测定OD685nm，分析微藻细胞生长情况。

用UASB出水、MBR出水对初始驯化藻种进行二次驯化，以上述方法中的初始驯化培养基为对照，分别向1 L锥形瓶中接入600 mL培养基，再接入初始驯化后藻种。其余条件同上。

1.2.3 不同温度的影响

分别使用UASB出水和MBR出水培养驯化后微藻，初始吸光度0.1左右。将微藻培养液分别放置于温度为15、20、25、30、35℃，光照强度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h条件下，测定微藻生长情况。

1.2.4 不同光照强度的影响

分别使用UASB出水和MBR出水培养驯化后微藻。将微藻培养液分别放置于光强为 1 500、3 000、4 500、6 000、8 000、10 000 lx，温度为25℃，光暗周期12 h∶12 h条件下，测定微藻生长情况。

1.2.5 污水净化效果

分别使用UASB出水和MBR出水在1.2.3和1.2.4中得到的最佳条件下培养驯化后微藻。为避免微藻进入衰亡期后，细胞破碎，营养物质溶出影响实验结果，本实验一次性培养6 d。将培养前后的藻液在4 000 r/min离心15 min，取上清液检测水质指标。

1.2.6 油脂提取

将按照1.2.5方法培养离心后的藻种收集，使用石英砂研磨破碎，采用索氏提取法进行油脂提取和含量分析。

2 结果与讨论

2.1 微藻藻种的驯化和选择

有研究表明，为使自然界微藻适应高浓度污水环境，需以一定比例的污水与传统标准培育基混合，对微藻进行初期的驯化培养［2］。通过对不同处理阶段的粪便污水的成分和BG11标准培养基的成分进行对比分析发现，UASB出水稀释5倍后，其总氮和总磷含量与BG11标准培养基相似。因此选择用蒸馏水稀释5倍的UASB出水按照1.2.2的方法对微藻进行初始驯化培养。由图1可知，在最初5～8 d，几种微藻的生长在粪便污水环境中有所抑制，处于适应期，小球藻-1在第6天，四尾栅藻在第8天开始快速增殖。而小球藻-2和布朗葡萄藻对粪便污水环境的适应能力较差。本研究选择初始驯化后的小球藻-1和四尾栅藻进行后续实验。小球藻-1和四尾栅藻在UASB出水、MBR出水中培养的结果显示，粪便污水对小球藻-1和四尾栅藻的生长有明显促进作用，在营养更为丰富的UASB出水中两种微藻均能迅速积累生物量。同时，粪便污水也一定程度上延缓了微藻细胞衰亡，尤其是小球藻在BG11标准培养基中第4～6天生长减缓，进入衰亡期。而在粪便污水中第8天OD才开始缓慢降低。到培养的第12天时，小球藻-1在UASB出水培养液中的吸光度为标准培养基的2.89倍，表现出显著差异。UASB出水、MBR出水均可以作为培养小球藻-1和四尾栅藻的优质培养基。

图1 不同培养基中微藻的生长情况

2.2 不同温度对污水中微藻生长情况的影响

有文献指出，温度是影响微藻生长和繁殖的重要环境因子之一，微藻的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的［3］。温度对微藻的生长和发育有调节作用，对酶的活性、营养物的吸收利用效率及细胞分裂的周期等诸多方面都存在不同程度的影响，温度通过控制有关酶的活性来影响其生长，也可能是由于使细胞出现质壁分离而影响正常细胞的生命活力。在适宜温度范围内，温度升高时细胞内的化学和酶促反应都以较快的速度进行，藻的生长也会越来越快，但是超过一定温度后，细胞组分、蛋白质和核酸会受到不可逆的损害，这样的损害是化学性的，这时细胞机能急剧下降到零。相反当温度降低时，细胞新陈代谢的化学反应速率会减慢［4］。本研究对利用粪便污水培养的小球藻-1和四尾栅藻在不同温度条件下的生长情况进行了观察对比。

由图2可知，在25℃下，小球藻-1和四尾栅藻的吸光度较高，生长速率较快，25℃是适宜UASB出水培养微藻的最佳温度。不同温度条件下MBR出水中培养微藻的生长情况与UASB出水的结果一致。

图2 温度对UASB出水中微藻生长情况的影响

实验结果表明，除最适生长温度25℃之外，小球藻和四尾栅藻在粪便污水中对温度的耐受范围比较广。粪便污水产业化处理过程中UASB出水和MABR出水温度在15℃以上，可直接用于微藻培养。

2.3 不同光强对污水中微藻生长情况的影响

本研究对不同光强下，小球藻-1和四尾栅藻在UASB污水和MBR污水培养基中的生长情况的对比观察结果表明，粪便污水中的小球藻-1和四尾栅藻对光照强度的耐受范围比较广，在1 500～10 000 lx均可生长，1 500 lx时生长较缓慢。相对而言，污水中小球藻-1比较耐高光强。欧阳峥嵘等［5］研究表明，藻类对光照强度有1个饱和点，低于光饱和点，随着光强的增加，藻类的光合速率加快；超过光饱和点，藻类的光合速率不再增加，甚至减弱、停止。还有研究发现［6］，在适宜的光强范围内，光辐射能可以被微藻充分利用而以热能形式耗散的量较少，光照强度增强会使微藻的光合电子传递速率和光合速率增高，促进微藻的生长和生物量积累。相反，当光强超过微藻的适宜光强范围时，微藻对光能的热耗散增加，并且热耗散的强度随光强的升高而升高［7］。因此，当光强较高时，光照强度的进一步升高并不一定会相应地使微藻的光合速率增高、生长加强，过量光能会以热耗散的形式消耗掉而不能用于光合生产。

由图3可知，在UASB出水和MBR出水培养基中，小球藻-1的光饱和点为8 000 lx，四尾栅藻的光饱和点为6 000 lx。在此光照强度下，两种微藻的生长情况最好。

图3 不同光强对UASB出水中微藻生长情况的影响

2.4 微藻对污水的净化效果

国内外的研究表明，微藻对于市政污水、剩余污泥中的氮、磷等营养物质有净化效果［1-2，8-9］。小球藻-1和四尾栅藻对UASB出水和MBR出水净化效果的数据显示，小球藻-1和四尾栅藻对UASB出水中总氮的去除率分别为9.88%和13.51%，总磷去除率分别为89.23%和72.45%，CODCr去除率分别为59.91%和69.31%。而对MBR出水，两种微藻都表现为对氮磷的去除效果显著，而对CODCr没有去除效果，反而培养后CODCr略有增加。这是因为UASB出水中的CODCr为微生物易于利用的小分子有机物，而MBR出水中的CODCr多为微生物碎片，MBR出水培养微藻后，液体中存在少量微藻细胞碎片，造成MBR出水中CODCr升高。本实验结果显示，小球藻-1和四尾栅藻能利用粪便污水中的氮磷，有效净化污水水质，降低粪便污水处理下游工序的处理负荷，见图4。

图4 微藻对粪便污水中污染指标的去除效果

2.5 粪便污水培养微藻的含油率测定

利用粪便污水培养的产油微藻的含油量的实验结果显示，两种微藻在MBR出水培养条件下的油脂含量均高于普通条件，而UASB出水培养条件下油脂含量比普通培养条件下低。UASB出水培养的小球藻-1含油率为25.68%，MBR出水培养含油率为35.54%，BG11标准培养基培养为35.54%。四尾栅藻在UASB出水培养中含油率为22.61%，MBR出水中含油率为33.50%，BG11标准培养基培养条件下为30.90%。分析差异是由于产油微藻在逆境条件下积累脂类，在诸多影响微藻生物量和脂肪含量的因素中，氮元素影响最为明显，在氮缺乏的条件下，微藻积累油脂。由此可见，如果考虑油脂产率，由粪便污水处理后的MBR出水培养的产油微藻含油率较高，可进行大规模培养。

3 结论

1）本研究表明产油微藻小球藻-1和四尾栅藻可利用经机械和生物处理后的城市粪便污水中的丰富营养成分，在温度25℃，通过高效的光合作用，吸收粪便污水中的有效物质快速增殖生长。

2）微藻在粪便污水中生长时，对污水中的污染指标有去除效果，尤其是UASB出水中，氮磷及CODCr含量均显著降低，可降低粪便污水处理下游工序的处理负荷。虽然利用UASB出水培养的产油微藻的油脂含量略低于普通培养条件，但是综合考虑污水处理效果和产油微藻的培养成本，UASB出水是培养产油微藻的优异培养基选择。

3）本研究得到利用城市粪便污水培养产油微藻的最佳条件，将粪便污水深度处理工艺与微藻生物柴油生产技术有机结合起来，以城市粪便污水作为资源进行微藻的规模化培养，既节约了水资源，降低微藻生物产油产业化发展中成本过高的问题，又转移和深度净化了城市粪便污水中的N和P等污染指标，有助于减轻水体富营养化，保护水体环境。本研究成果具有良好的发展前景和应用潜力。

［1］吕素娟.城市生活废水用于培养产油微藻［D］．青岛：中国海洋大学，2011.

［2］刘建强.市政污水微藻种类鉴定及污水培养小球藻研究［D］.南昌：南昌大学，2011.

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［4］苏秀燕.能源微藻小球藻的污水培养条件研究［D］.新乡：河南师范大学，2011.

［5］欧阳峥嵘，温小斌，耿亚红，等.光照强度、温度、pH、盐度对小球藻（Chlorella） 光合作用的影响［J］.武汉植物学研究，2010，28（1）：49-55.

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