食管癌干细胞放射抗性相关机制的研究进展

邱琪 于静萍 孙苏平

南京医科大学江苏省常州市第二人民医院放疗科，江苏 常州 213000

食管癌（esophageal cancer，EC）是最常见的致命癌症之一，其5年总体生存率不到20%，我国尤为高发[1]。虽然在世界范围内大量基础和临床研究已经开展，而且肿瘤分子生物学在食管癌中的研究近年来已取得突破性进展，但食管癌的诊断水平和治疗疗效目前仍无明显提高，晚期食管癌的死亡率总体持平，常规治疗后肿瘤的复发与转移仍然是现今需要面对的严峻问题。较多的临床研究发现，放射治疗的失败是食管癌预后不良的主要原因之一，由于肿瘤对放疗产生了抗拒性，存活肿瘤干细胞再增殖，最终导致肿瘤复发或远处转移或[2]。

1 肿瘤干细胞生物特性及其鉴定

Reya等[3]于2001年提出了“肿瘤干细胞”学说。在肿瘤细胞中，一些细胞具有类似干细胞的特性，包括自我更新、多向分化的能力、广泛增殖的潜能、高致瘤性和耐药性等，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）。在肿瘤学中，肿瘤干细胞已成为一个重要的研究领域，肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞来源于组织干细胞的突变或者祖细胞通过基因突变重新获得自我更新能力，在大多数类型的肿瘤组织中都有一定数量的细胞表现出干细胞特性，可能具有与干细胞相同的表型和标记。CD133是目前为止已证实的最常见的一种肿瘤干细胞标志物，最早在白血病干细胞中被发现[4]。此后发现在许多不同类型的肿瘤细胞中均有CD133的表达，包括肺癌、胶质瘤、结/直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌[5]。利用Hoechst染料和流式细胞术进行造血干/祖细胞分离时发现一群特殊细胞，既具有类似干细胞的自我更新和多向分化潜能，还具有独特的表型标记和生物学特征，代表了一种新的干细胞类型，被称为侧群细胞（side population cell，SPcell）[6]。

2 食管癌干细胞生物特性及其鉴定

2003年，Okumura等[7]应用低亲和性神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor，P75NTR）为表面标记对人食管鳞状上皮细胞进行了分选，并证明正常食管上皮细胞中的P75NTR阳性细胞具有增殖、自我更新及多向分化能力，经鉴定为食管上皮干细胞。自此，食管癌干细胞的分离鉴定就有了基本的标准，为研究其生物学特性奠定了基础。研究表明，Oct-4、Sox-2、Bmi-1、Notch和β-catenin是肿瘤的“干细胞基因”，Huang等[8]在食管鳞癌SP细胞分选中发现，“干细胞基因”Oct-4、Sox-2、Bmi-1和Zfx在SP细胞中的表达比非SP细胞更高。另一常见的干细胞标志物CD44是Wnt/βcatenin通路的下游作用分子，最早从乳腺癌细胞中分选出具有CD44（＋）CD24（－/low）Lineage（－）表型的细胞时被确定[9]，后又发现肺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌中都有表达并用于干细胞的分选[10]。在食管鳞状细胞癌中发现CD44＋细胞具有自我更新、致瘤性等干细胞的特性，并且与食管癌的不良预后密切相关，为食管癌干细胞的鉴定和研究提供了一定的依据，但更多的表型和标志尚有待进一步的探索。

3 肿瘤干细胞放射抗拒性的相关机制

肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞相比具有自我更新、多向分化的潜能，在肿瘤的发生、转移和放化疗耐受中扮演着重要的角色。研究表明从不同类型的肿瘤细胞中分选出的肿瘤干细胞，在放化疗后生存能力比普通肿瘤细胞生存能力更强[11]，具有放射抵抗的潜能。肿瘤干细胞产生放射抗性的机制可能与细胞周期时相再分布[12]、较高的自由基清除水平[13]、高效的DNA损伤修复机制[13]、细胞凋亡和增殖等信号转导通路的改变[13]有关。

3.1 细胞周期时相再分布

细胞处于不同的细胞周期时放射敏感性不同，M期细胞对射线特别敏感，而G0期细胞对射线最为抗拒，正常组织干细胞和肿瘤干细胞通常处于细胞周期的静止状态，即G0期。Wnt/βcatenin途径可能参与肿瘤干细胞周期再分布[14]，Kendziorra等[15]发现Wnt转录因子（T cell factor-4，TCF-4）在直肠癌细胞系的过度表达导致了细胞的耐药性和放射抗拒性，沉默的TCF-4诱导G2/M期阻滞，使细胞对放射的敏感性显著增加。

3.2 较高的自由基清除水平

肿瘤细胞常处于缺氧的环境中，使细胞中的ROS水平降低，同时缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIF）的水平升高，与肿瘤的放射抗拒密切相关[16]。肿瘤干细胞具有更高的活性氧基团（reactive oxygen species，ROS）清除水平，产生的ROS较少，DNA的损伤较非肿瘤干细胞小。研究发现中枢神经系统干细胞和造血干细胞的ROS水平比普通体细胞低，这种差异对维持干细胞功能至关重要。Diehn等[17]发现人和小鼠乳腺肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞相比含有更低浓度的ROS，而低水平的ROS与较强的自由基清除能力有关，放射所致的DNA损伤明显少于非肿瘤干细胞，因此更具有放射抗拒性。组蛋白H2A磷酸化被认为是DNA损伤修复的标志[18]，乳腺癌干细胞受到照射后会产生更少的γ-H2AX，而且在小鼠乳腺癌干细胞的研究中发现，肿瘤干细胞中γ-H2AX的清除速度较非肿瘤干细胞更快[5]。

3.3 高效的D NA损伤修复机制

电离辐射的生物有效性取决于细胞不可修复的DNA损伤，主要是DNA双链断裂，其次是累积的亚致死DNA损伤，正常组织与肿瘤组织之间往往有不同的修复能力。Bao等[19]认为肿瘤干细胞具有更强的DNA损伤检查点和损伤修复能力，因此导致细胞的放射抗拒。检查点激酶（checkpoint kinase，Chk）——Chk1和Chk2在肿瘤干细胞的放射抗性中起重要作用[20]，通过抑制Chk1和Chk2的活性，可削弱脑胶质瘤干细胞对照射的抵抗能力，恢复其对放射的敏感性[19]。同时还发现脑胶质瘤CD133＋细胞和CD133－细胞在受到相同剂量照射后DNA的损伤程度相同，但CD133＋细胞能更有效地激活对DNA损伤的应答，修复照射所致的DNA损伤，使细胞凋亡率显著降低[21]。

3.4 信号转导通路的改变

肿瘤干细胞在肿瘤各个阶段发挥作用与众多的基因改变和信号通路有关，如Wnt/β-catenin、Notch、PI3-K、MAPK、NF-κB。Wnt/β-catenin可以赋予CSC耐辐射的能力，Chen等[22]发现鼠乳腺癌细胞系COMMA-Dβ-geo中的CSC群体Sca+细胞能耐受2 Gy的照射剂量，细胞内β-catenin和Survivin处于高表达水平，产生的γ-H2AX较少，DNA损伤也较少。研究发现Notch通路也涉及肿瘤干细胞生物特性的调控，Wang等[23]采用Notch抑制剂——γ分泌酶抑制剂（GSI）后发现，胶质瘤干细胞通过降低Akt的活性和Mcl-1的水平发挥其放射增敏效应，提高了放射诱导的细胞凋亡率。同时Notch-1或Notch-2基因的敲除也会提高神经胶质瘤干细胞对放射的敏感性，减少异种移植瘤的形成。磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）广泛涉及肿瘤组织的各种异常生物学特征，如无限复制能力、维持细胞在恶性环境下的生存、肿瘤易于向周边组织浸润及远处转移[24]，与放射治疗后的肿瘤局部控制情况密切相关，同时PI3-K基因的敲除则通过抑制RAS途径增强肿瘤细胞的放射反应。PTEN作为一种可能的肿瘤抑制基因，通过作用于PI3-K抑制肿瘤的增殖转移，提高细胞的放射敏感性[25]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）参与调节肿瘤细胞的多种生物学过程，受酪氨酸激酶受体或突变的通路分子激活，在一些常见的肿瘤干细胞中发现MAPK分子异常激活。在H-Ras诱导的细胞侵袭和转移中，p38/MAPK活性的抑制降低了细胞的运动能力，对于肿瘤细胞的发生、凋亡、转移具有重要作用。核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号途径参与肿瘤发生、侵袭、诱导辐射耐受性和耐药性，研究表明NF-κB信号通路的选择性抑制剂可以提高放射治疗的疗效[26]。

4 食管癌干细胞放射抗拒性的相关机制

在包括中国在内的东亚国家，食管癌的主要组织学类型是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），该型对放射治疗有较强的敏感性，因此放射治疗是食管癌的主要治疗手段之一，而放射抗拒被认为是食管癌局部复发和放疗失败的重要原因。Smit等[27]研究发现食管癌组织中部分细胞具有CD44＋/CD24－表型，在体外实验中食管癌CD44＋/CD24－细胞表现出与干细胞相似的特性，更具有侵袭扩散的潜能和放射抗性。食管肿瘤组织在放射治疗过程中激活了各种信号分子，导致无法修复的DNA损伤，最终引起细胞凋亡。然而由于放射所致的DNA损伤常常被扰乱，如抗凋亡程序的激活、干细胞基因的高表达、细胞周期的异常调控，使肿瘤细胞对放射产生抗拒性。

4.1 抗凋亡程序的激活

食管癌干细胞受到电离辐射刺激时，特殊的调节机制就会启动，同时PI3-K、MAPK、NF-κB通路会随之级联激活，抗凋亡蛋白Mcl-1的表达增加，使细胞凋亡率降低。Fulda等[28]发现异常激活的抗凋亡程序，高表达的抗凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）能够降低放射治疗的效果。而其中XIAP发挥的抗凋亡作用最强，通过激活NF-κB参与诱导肿瘤的放射抗性和耐药性，还可以通过细胞周期阻滞、自我更新和缺氧环境影响放射治疗的效果。

4.2 干细胞基因的高表达

Zhang等[29]通过食管癌连续分割照射获得一群具有放射抗性的细胞，并表现出CSC的特性，如高水平的端粒酶活性、SPcell的富集、β-catenin、Oct-3/4和β1-integrin的高表达以及凋亡基因的下调。经过病毒载体转染后表达凋亡基因Ad/TRAIL-E1的肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞对照射有更高的敏感性。Che等[30]经过分次照射获得具有放射抗性的食管癌干细胞（Eca109R50Gy），与普通放射敏感的肿瘤细胞相比，Eca109R50Gy细胞的干细胞特性和肿瘤形成的潜能显著增强。βcatenin的表达与放射剂量有一定的相关性，随着放射剂量增加，β-catenin的表达也增强。同时发现Wnt拮抗剂Dkk-1和COX-2抑制剂NS398能通过抑制β-catenin的表达增强Eca109R50Gy细胞的放射敏感性。Bmi-1基因是PcG家族中的核心成员之一，在肿瘤细胞中Bmi-1呈高表达状态，使肿瘤细胞不断更新成为肿瘤干细胞，其表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭、预后等相关。Wang等[31]采用分次照射获得具有放射抗性的食管癌干细胞中，Bmi-1表达显著高于亲本细胞。而经过Bmi-1耗损后，肿瘤细胞通过诱导凋亡程序，提高ROS、氧化酶和γ-H2AX水平，明显增强肿瘤细胞的放射反应。

4.3 细胞周期的异常调控

p27KIP1是周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂，具有限制性调节细胞周期进程的作用，使细胞停滞在G1期，细胞生长停止，可能是一种肿瘤抑制物。Tong等[32]发现低表达的p27KIP1改变了细胞周期状态，导致食管癌细胞的放射抗拒。细胞周期性蛋白（S phase kinase protein 2，Skp2）参与p27KIP1泛素化降解过程，使其在许多恶性肿瘤中处于低表达水平，并正性调控G1/S期的转换。Wang等[33]研究发现在ESCC组织中Skp2的表达升高，通过作用于p27KIP1促进了细胞的放射抗性，而Skp2基因的敲除可提高肿瘤细胞的放射敏感性。

5 展望

肿瘤干细胞对肿瘤的形成和进展具有重要作用，是促进食管癌发生、发展、侵袭转移、耐药性和放射抗性的重要机制之一，肿瘤干细胞的再增殖分化导致食管癌治疗的失败，成为预后不良的重要因素，为新的治疗提供了靶标。凋亡基因的调控、DNA损伤修复能力、多种信号分子通路、细胞周期状态等均参与肿瘤干细胞对放射敏感性的调节，各种因素及分子之间相互协调共同发挥对放射抗性的影响。相比其他实体瘤干细胞，食管癌干细胞尚缺少特异性的标志物，对其生物学特性和分选鉴定方法以及肿瘤干细胞在食管癌发生发展、侵袭转移、放化疗抵抗中的详细机制仍研究甚少。因此，有必要对其进行深入的研究，这样新的治疗方法才有可能解决食管癌放射治疗失败的问题，从而降低肿瘤的复发和转移几率。

［1］Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

［2］Brunner TB,Kunz-Schughart LA,Grosse-Gehling P,et al.Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy[J].Semin Radiat Oncol,2012,22(2):151-174.

［3］Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem cells,cancer,and cancer stem cells[J].Nature,2001,414(6859):105-111.

［4］Miraglia S,Godfrey W,Yin AH,et al.A novel fivetransmembrane hematopoietic stem cell antigen:isolation,characterization,and molecular cloning[J].Blood,1997,90(12):5013-5021.

［5］Nguyen GH,Murph MM,Chang JY.Cancer Stem Cell Radioresistance and Enrichment:Where Frontline Radiation Therapy May Fail in Lung and Esophageal Cancers[J].Cancers(Basel),2011,3(1):1232-1252.

［6］Hirschmann-Jax C,Foster AE,Wulf GG,et al.A distinct"side population"of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(39):14228-14233.

［7］Okumura T,Shimada Y,Imamura M,et al.Neurotrophin receptor p75(NTR)characterizes human esophageal keratinocyte stem cells in vitro[J].Oncogene,2003,22(26):4017-4026.

［8］Huang D,Gao Q,Guo L,et al.Isolation and identification of cancer stem-like cells in esophageal carcinoma cell lines[J].Stem Cells Dev,2009,18(3):465-473.

［9］Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

［10］Medema JP.Cancer stem cells:the challenges ahead[J].Nat Cell Biol,2013,15(4):338-344.

［11］Peitzsch C,Kurth I,Kunz-Schughart L,et al.Discovery of the cancer stem cell related determinants of radioresistance[J].Radiother Oncol,2013,108(3):378-387.

［12］Moncharmont C,Levy A,Gilormini M,et al.Targeting a cornerstone of radiation resistance:cancer stem cell[J].Cancer Lett,2012,322(2):139-147.

［13］Ogawa K,Yoshioka Y,Isohashi F,et al.Radiotherapy targeting cancer stem cells:current views and future perspectives[J].Anticancer Res,2013,33(3):747-754.

［14］Wilson A,Laurenti E,Oser G,et al.Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair[J].Cell,2008,135(6):11.129.

［15］Kendziorra E,Ahlborn K,Spitzner M,et al.Silencing of the Wnt transcription factor TCF4 sensitizes colorectal cancer cells to(chemo-)radiotherapy[J].Carcinogenesis,2011,32(12):1824-1831.

［16］Dewhirst MW,Cao Y,Moeller B.Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response[J].Nat Rev Cancer,2008,8(6):425-437.

［17］Diehn M,Cho RW,Lobo NA,et al.Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells[J].Nature,2009,458(7239):780-783.

［18］Redon CE,Dickey JS,Bonner WM,et al.Gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin[J].Adv Space Res,2009,43(8):1171-1178.

［19］Bao S,Wu Q,McLendon RE,et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature,2006,444(7120):756-760.

［20］Wang X,Ma Z,Xiao Z,et al.Chk1 knockdown confers radiosensitization in prostate cancer stem cells[J].Oncol Rep,2012,28(6):2247-2254.

［21］McCord AM,Jamal M,Williams ES,et al.CD133+glioblastoma stem-like cells are radiosensitive with a defective DNA damage response compared with established cell lines[J].Clin Cancer Res,2009,15(16):5145-5153.

［22］Chen MS,Woodward WA,Behbod F,et al.Wnt/betacatenin mediates radiation resistance of Sca1+progenitors in an immortalized mammary gland cell line[J].J Cell Sci,2007,120(Pt 3):468-477.

［23］Wang J,Wakeman TP,Lathia JD,et al.Notch promotes radioresistance of glioma stem cells[J].Stem Cells,2010,28(1):17-28.

［24］Bussink J,van der Kogel AJ,Kaanders JH.Activation of the PI3-K/AKT pathway and implications for radioresistance mechanisms in head and neck cancer[J].Lancet Oncol,2008,9(3):288-296.

［25］McKenna WG,Muschel RJ.Targeting tumor cells by enhancing radiation sensitivity[J].Genes Chromosomes Cancer,2003,38(4):3.38.

［26］Ahmed KM,Zhang H,Park CC.NF-kappaB regulates radioresistance mediated by beta1-integrin in three-dimensional culture of breast cancer cells[J].Cancer Res,2013,73(12):3737-3748.

［27］Smit JK,Faber H,Niemantsverdriet M,et al.Prediction of response to radiotherapy in the treatment of esophageal cancer using stem cell markers[J].Radiother Oncol,2013,107(3):434-441.

［28］Fulda S.Inhibitor of Apoptosis(IAP)proteins as therapeutic targets for radiosensitization of human cancers[J].Cancer Treat Rev,2012,38(6):760-766.

［29］Zhang X,Komaki R,Wang L,et al.Treatment of radioresistant stem-like esophageal cancer cells by an apoptotic gene-armed,telomerase-specific oncolytic adenovirus[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2813-2823.

［30］Che SM,Zhang XZ,Liu XL,et al.The radiosensitization effect of NS398 on esophageal cancer stem celllike radioresistant cells[J].Dis Esophagus,2011,24(4):265-273.

［31］Wang G,Liu L,Sharma S,et al.Bmi-1 confers adaptive radioresistance to KYSE-150R esophageal carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,425(2):309-314.

［32］Tong Q,Zhang W,Jin S,et al.The relationship between p27(kip1)expression and the change of radiosensitivity of esophageal carcinoma cells[J].Scand J Gastroenterol,2011,46(2):173-176.

［33］Wang XC,Tian LL,Tian J,et al.Overexpression of SKP2 promotes the radiation resistance of esophageal squamous cell carcinoma[J].Radiat Res,2012,177(1):52-58.