利用SRAP标记分析海南旱稻地方品种的遗传多样性及其分子身份证的构建

姚宇飞王英，2庄南生，2高和琼

（ 1.海南大学农学院，海口 570228；2.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 ，海口 570228）

利用SRAP标记分析海南旱稻地方品种的遗传多样性及其分子身份证的构建

姚宇飞1王英1，2庄南生1，2高和琼1

（ 1.海南大学农学院，海口 570228；2.热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 ，海口 570228）

利用SRAP标记对来自海南省的28份旱稻种质进行了亲缘关系分析。从255对引物组合中筛选出46对扩增条带清晰、多态性高的引物组合，并选用其中的18对引物组合对28份材料进行SRAP扩增，共扩增出180个条带，其中多态性条带160条，多态性比率为87.75%，平均每对引物组合产生10个条带和8.9个多态性条带。并且，运用UPMGA方法进行的聚类分析结果表明，供试旱稻种质的遗传相似系数范围为0.687 0-0.921 2，在遗传相似系数0.687 0处分为两大类群，第I类群全部为海南山栏稻种质，第Ⅱ类群为海南地方旱稻坡压和本研究组自育旱稻品种。对海南旱稻地方品种的划分表明，山栏稻种质间亲缘关系较近，海南地方旱稻坡压可能与籼型水稻种质具有一定的遗传相似性。此外，还构建了28份海南省旱稻种质的SRAP标记分子身份证，可为山栏稻种质的遗传亲缘关系，种质鉴定及新品种选育等方面提供依据。

旱稻 山栏稻 SRAP标记 遗传多样性 分子身份证

我国旱稻种质资源丰富，共有3 100多份，占地方品种的6.2%，主要分布于云南、贵州和海南等省［1］。据王官远等［2］对海南稻种资源的考察结果表明，旱稻资源是海南稻种资源的主体并占总数的80%，而山栏稻又占海南旱稻资源的80%以上［3］。可见海南旱稻种质主要为山栏稻，因此，山栏稻在

海南稻种资源中占据特殊地位［4］。山栏稻是旱稻的一大类，具有极其重要的社会、生态和经济价值。山栏稻亦作“砍山”或“砍山栏”，是一种在山地上采用刀耕火种方式种植旱稻的原始农业耕作方法，用这种方式种植的旱稻俗称为山栏稻［1］。山栏稻作为海南省独有的适应热带、亚热带山地（旱地）种植的珍贵地方旱稻种质，资源丰富，具有抗旱、耐瘠、高蛋白、高赖氨酸等优良品质特性和独特的香味及高营养价值等特点。目前，国内外有关以海南山栏稻种质为研究对象的报道不多，并主要集中在农艺性状、抗旱生理特性、核心种质的构建、遗传分析、类缘分析等方面［5-8］，而有关利用分子标记进行遗传多样性研究的报道甚少，仅见陈良斌等［9］利用SSR标记对海南普通野生稻和山栏稻的遗传多样性进行过比较分析；本课题组利用RAPD标记对包括海南山栏稻在内的多份旱稻种质进行了遗传多样性分析［10，11］。相关序列扩增多态性（Sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）分子标记，通过独特的双引物设计对基因的开放式阅读框（Open reading frames，ORFs）特定区域进行扩增，因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性，所以此方法具有简便、产率高、可显示大量的共显性标记、易从序列中得到分离的条带等优点，在遗传学和育种学领域具有广泛的应用前景。自Li 等［12］于2001年在芸薹属植物中开发出新型分子标记技术SRAP标记建立以来，其已成功地应用于马铃薯［13］、西瓜［14］、番茄［15］等作物的分子标记辅助遗传育种，豌豆［16］、油菜［17］、棉花［18］、西葫芦和笋瓜［19］的遗传多样性分析，羽衣甘蓝×花椰菜［20］、油菜籽［21］、芸薹［22］、甘蓝型油菜籽［23］的分子连锁图谱构建，芥子油糖苷合成基因［24］的定位以及拟南芥和甘蓝［20］的同源性研究等方面。而利用SRAP标记分析以山栏稻为主体的海南地方旱稻遗传多样性及其分子身份证数据库的构建尚未见报道。本研究首次利用18对SRAP标记引物组合对28份海南旱稻种质进行检测，探讨其遗传相似性，并构建分子身份证数据库，旨在通过对海南旱稻地方品种资源遗传多样性的研究，为海南旱稻地方品种鉴别、种质杂交及抗旱型稻作的选育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的海南旱稻品种共28份（表1），均由海南大学农学院生物技术系遗传育种课题组提供。其中24份为海南旱稻地方品种（23份为海南山栏稻，1份为海南地方旱稻坡压），取自海南琼中、保亭、白沙、乐东等地山坡地种植的原始品种材料，并经本研究组提纯；另外4份为本研究组自育的热大系列旱稻，包括热大1号：{珍汕97A×［（七卢粘×S12）F3×明恢63］F1}F8；热大2号：{珍汕97A×［（S14×香珍矮）F2×明恢63］F1}F8；热大7号：［珍汕97A×（S12×汕优广12）F2］F8；2000GI09：（S12×汕优广12）F11。

表1 28份海南旱稻种质编号及名称

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与质量检测 海南旱稻地方品种基因组总DNA的提取采用Johansen［25］提供的CTAB方法，加以改进简化。

1.2.2 SRAP引物 根据Li等［12］设计SRAP引物的原则，即上游引物应为10个无特异组成的填充序列与CCGG序列和3个选择性碱基组成，下游引物应为11个无特异组成的填充序列与AATT序列和3个选择性碱基组成，借用徐鲜均［26］的引物设计，交由上海Invitrogen公司合成了上下游向引物各15条，见表2。

表2 SRAP标记所用的上下游引物

1.2.3 SRAP反应体系及扩增程序 主要参考Li等［12］SRAP技术体系，并综合王呈丹等［27］、崔竣杰等［28］技术体系进行PCR扩增。SRAP-PCR反应总体积20 μL，包括：10×Buffer（Mg2+plus）2.0 μL，DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2.0 μL，正反引物（10 pmol/L）各0.6 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 12.5 μL。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃1 min，共5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，共35 个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。采用2%的琼脂糖凝胶（加入GoldviewTM使终浓度为0.5 μg/mL）凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.4 数据统计与分析 对SRAP试验结果进行记录，采用人工读带的方法根据PCR扩增产物的电泳结果，在凝胶的某个相同迁移率位置上有DNA条带的记为“1”，无DNA条带记为“0”，获得每个引物的Excel 0-1矩阵。扩增片段大小参照DNA ladder估测，扩增片段编号由引物编号加片段大小组成［29］。应用NTSYS-pc2.10软件处理并采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析，得到遗传相似系数，并根据遗传相似系数建立聚类图［30-32］。

1.2.5 28份海南旱稻种质指纹图谱构建与置信概率分析 参考吴渝生等［33］研究进行海南旱稻地方品种指纹图谱构建与置信概率分析。其中指纹图谱出现的概率公式P=1/2n（2为等位基因的数目，n为多态位点数，2n则为检n个位点涉及的所有可能的试验材料个数），统计图谱的置信概率。

1.2.6 28份海南旱稻种质SRAP标记分子身份证构建 综合参考郑海燕等［34］、王晓飞等［35］研究方法并加以改进，以此构建供试材料的分子身份证。

2 结果

2.1 SRAP多态性引物组合的筛选

以4份旱稻种质基因组DNA为模板（巴西陆稻、云陆8号为对照，S08、S10为供试种质代表），利用上下游引物各15条随机搭配，共组成225对引物组合进行筛选，以能扩增出较多清晰条带为标准（图1），最终筛选出多态性丰富的引物组合46对（表3）。

图1 Me3+Em1-Em8引物组合筛选电泳图

表3 筛选出的46对SRAP多态性引物组

2.2 28 份海南旱稻种质SRAP扩增

从筛选出的46对引物组合中，挑选出多态性丰富、条带清晰分明的18对优质引物组合对28份供试材料进行扩增，并构建SRAP指纹图谱（图2），巴西陆稻仅作为群外对照。结果（表4）表明，18对引物组合共扩增出180条带，平均每对引物组合扩增10条。多态性条带共160条，平均每对引物组合多态性条带8.9条。引物组合产生的多态性条带比例为50.00%-100%，平均为87.75%。

图2 Me3+Em7引物组合构建的28份海南旱稻种质SRAP指纹图谱

2.3 海南旱稻种质聚类分析

为了便于分析海南旱稻地方品种之间的亲缘关系，利用所得到的180个条带对24份海南旱稻地方品种（23份为海南山栏稻，1份为海南地方旱稻坡压），4份本研究组自育的热大系列旱稻共28份海南旱稻种质材料，以及1份巴西陆稻作为群外对照，进行聚类分析并构建亲缘关系树状图（图3）。结果表明，遗传相似系数范围为0.687 0-0.921 2，平均0.837 1，变幅0.234 2。且在遗传相似系数为0.687 0处明显分为Ⅰ、Ⅱ两大类群，其中第Ⅰ类群包括：S01、S02、S03、S04、S05、S06、S07、S08、S08长、S08短、S09、S10、S11、S12、S13、S14、S16、S23、S24、S25、S26、S27、S28等共23份种质且全部为山栏稻种质，第Ⅱ类群包括：坡压、热大1号、热大2号、热大7号、2000GI09及巴西陆稻共6份种质。

2.4 28 份海南旱稻种质指纹图谱构建与置信概率分析

对筛选出的18对引物多次重复进行PCR扩增，通过电泳图谱选取多态性最好且稳定的5对核心引物，其编号分别为：Me3-Em7（图2）、Me4-Em6

（图4）、Me4-Em14、Me5-Em7、Me14-Em15。根据最小差异原则兼顾鉴别品种指纹图谱的置信概率，选用此5对核心引物组合，可将供试的24份海南旱稻地方品种（23份为海南山栏稻，1份为海南地方旱稻坡压），4份本研究组自育的热大系列旱稻全部区分开来，将代表等位基因位点有无的1和0按顺序组成数字指纹（表5）。这5对核心引物组合的多态性位点数为57，根据概率公式1/2n可知，在224≈1.441×1017份海南地方旱稻品种中才有可能存在2个品种的电泳图谱完全相同，置信概率达到99.99%，该指纹图谱可准确检测其中任何一个品种。

表4 28份海南旱稻种质的SRAP引物组合扩增结果

图3 基于SRAP分析的海南旱稻种质的聚类图

2.5 28 份海南旱稻种质SRAP标记分子身份证构建

本研究共从255对引物中反复筛选出以上5对核心引物，其稳定性良好，多态性丰富，具有一定的说服力。以这5对SRAP核心引物的指纹组合，用相同迁移位置上条带的有无来构建28份海南旱稻种质的黑白格指纹图谱（图5），就可以鉴别供试的地方旱稻品种。有的材料只要利用1对SRAP引物就可以鉴别出来，而有的品种则需要利用这5对核心引物的相互组合才能区分。

将28份供试材料的数字指纹图谱二进制数据，分别从上至下输入并计算转化成十进制的数据，例如1号品种S01的二进制的数值为：00000100100 00000110111001010000100100001000101010011001 10转换为十进制数值为：2535169982605926xx，共计18 位（不足18位用x补位）。这些十进制的数字串连起来就构成了28份材料的分子身份证（表6）。比较两种数字形式可以看出，数据转化后，数据位数由57 变为18，约减少了2/3，两种数字所表达的信息是相同的，因此用十进制数字表示更为直观，并且18位字符也与中国公民身份证位数吻合，更有利于种质资源数据库的建立。

3 讨论

3.1 28 份海南旱稻种质的SRAP标记遗传多样性分析

图4 Me4+Em6引物组合构建的海南旱稻种质SRAP指纹图谱

表5 28份海南旱稻种质的DNA数字指纹图谱

关于海南旱稻地方品种的遗传多样性研究，陈良斌等［9］曾利用20对SSR标记引物，对参试的5份稻种进行扩增共检测到180个等位基因座位，最大遗传距离为0.356，最小遗传距离为0.133，平均遗传距离为0.246，其中供试的山栏稻种质总体平均遗传距离为0.246；曾莉娟等［10］利用10个RAPD标记引物对32份稻种进行扩增，共获得99条清晰可辨的条带，其中93条为多态性条带，占总扩增片段的93.9%，遗传距离在 0.11-0.75之间，平均为0.35；王英等［11］用22条RAPD标记引物对参试的49份旱稻种质（其中包含本研究所用的全部种质）扩增，共获得375个条带，多态性条带为306条，多态性为81.60%，其遗传相似系数变化范围在0.546-0.952，平均为0.828。本研究表明供试的28份海南省地方旱稻种质材料经18对SRAP引物组合

扩增共获得180条带，平均每对引物组合10条。多态性条带共160条，平均每对引物组合8.9条，多态性条带比例为50.00%-100%，平均87.75%。该数据与陈良斌等的结果有较大差异，主要原因可能为供试材料、试验环境及分子标记方法有所不同；由于供试材料完全相同且试验环境相近，而我们的数据与王英等所得结果较为接近，微小差异是因为所采用分子标记方法不同造成的。SRAP标记针对ORFs进行扩增，因而对于基因相对少的着丝粒以及端粒附近的位点较少，如果结合这些区域的SSR标记，将可获得覆盖整个基因组的连锁图［36］。

表6 28份海南旱稻种质的SRAP分子标记身份证

3.2 28 份海南旱稻种质的聚类分析

参照王英等［11］的报道可知，其遗传相似系数范围为0.607 9-0.952 3，平均为0.828，变幅为0.344 4，在相似系数0.607 9处，可将49份旱稻种质分为两大类，其中S10与巴西陆稻聚为一类；在相似系数0.830 3处，所有的山栏稻种质（除S10外）聚为一类；在相似系数0.797 3处，热大系列旱稻与坡压旱稻等7个种质聚为一类。本研究结果表明，供试种质间的遗传相似系数变异范围为0.687 0-0.921 2，平均0.837 1，变幅0. 234 2。在遗传相似系数为0.687 0处分为Ⅰ、Ⅱ两大类群，其中第Ⅰ类群全部为山栏稻种质，其中第Ⅱ类包括4份本研究组自育的热大系列旱稻，海南地方旱稻坡压和巴西陆稻，与王英的研究结果吻合。郑成木等［37，38］对山栏稻田间形态和生理特性的调查，戚经文根据对稻作种质生物学性状的观察结果，初步将山栏稻主要划归为偏粳型、粳型旱稻，坡压划归为籼稻类型，巴西陆稻为籼型常规旱稻［3］，并经查证本校自育品种由S09、S12、S14等地方旱稻种质品种与籼型水稻杂交而成［5］。本研究通过SRAP标记分析所得的聚类结果与前人所进行的稻种类型分类结果相符，进一步从分子水平证明了以上观点。由此可推断出海南山栏稻种质在遗传相似性上相近，极有可能表现出相同的生理生态特征；S27和S28在遗传相似系数最大值0.9212处仍未分离，为近缘品系，田间形态可能相似；海南地方旱稻坡压为籼型旱稻，与籼型水稻种质具有一定的遗传相似性，可能表现出相同的生理生态特性，有待于进一步探究。

3.3 海南旱稻地方品种的分子身份证构建

本研究从筛选出的18对SRAP引物中遴选多态性好的5对核心引物，建立了28份海南省旱稻地方品种资源特异的分子身份证，以在相同迁移位置上条带的有无构建了28份海南旱稻种质材料的DNA指纹图谱，并将条带的有或无转化成1或0，构成了一组57位的二进制数据，将每份材料的二进制数据转换为十进制数据，构成了每份材料的分子身份证。在转换后的数据中没有重复数据出现，也说明了利用该方法建立海南旱稻地方品种分子身份证的有效性。初步建立了海南旱稻地方品种SRAP标记分子身份证体系，为海南旱稻地方品种资源的分子身份证数据库的构建打下了基础。在棉花［39］、亚

麻［40］研究中已经构建了数字形式的指纹图谱，而在海南旱稻地方品种方面尚属首次。然而，在海南旱稻地方品种分子身份证构建方面，尚有待选用更多数量的引物和品种进行分析，并利用RAPD、SSR及ISSR 等分子标记手段来完善种质资源的分子身份证体系，同时，可以把不同引物组合后进行PCR扩增和检测，提高鉴定的效率。电泳条带密集不容易分辨的引物组合可以采用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测［34］，最终构建出简明有效的海南旱稻地方品种分子身份证体系，从而快速、准确地鉴定和区分供试材料是否为海南旱稻地方品种，为稻作选育种研究提供一定的科学保证。

图5 SRAP标记构建28份海南旱稻种质的指纹图谱

4 结论

本研究采用SRAP分子标记技术对28份旱稻种质的遗传基础进行了分析。以巴西陆稻、S08、S10、云陆8号4份种质基因组DNA为模板，从255对SRAP引物组合中筛选出了46对多态性较强的引物，构建了28份旱稻种质的SRAP指纹图谱，共扩增出180个条带，多态性条带为160条，其多态性为87.75%，并依据指纹图谱构建了28份海南省旱稻种质的SRAP标记分子身份证。参试旱稻种质的遗传相似系数变化范围为0.687 0-0.921 2，平均为0.837 1。利用UPGMA方法进行聚类分析结果表明，供试旱稻种质分为两大类，第I类群全部为海南山栏稻种质，第Ⅱ类群为海南地方旱稻坡压，本研究组自育旱稻品种和巴西陆稻，推断出山栏稻种质间亲缘关系相近，S27和S28为近缘品系，海南地方旱稻坡压与籼型水稻种质具有一定的遗传相似性。

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（责任编辑 李楠）

Analysis on Genetic Diversity of Hainan Upland Rice Local Varietiesand Establishment of Molecular ID with SRAP Markers

Yao Yufei1Wang Ying1，2Zhuang Nansheng1，2Gao Heqiong1
（1. Agriculture College of Hainan University，Haikou 570228；2. Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Grop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education，Haikou 570228）

SRAP markers were used to analyze the genetic relationships of 28 upland rice local varieties from Hainan province. Fortysix primer combinations with abundant polymorphism were selected from 255 primer combinations, and 18 primer combinations were picked to amplify the 28 material. A total of 180 bands were scored, and 160（87.75%）out of them were polymorphic, with an average of 10 bands and 8.9 polymorphic bands for each primer combination. Cluster analysis using UPMGA method showed that the genetic similarity coefficient ranged from 0.687 0 to 0.921 2 among the test upland rice varieties. The tested materials were classified into two clusters at the similarity coefficient of 0.687 0, and cluster I included Hainan shanlan upland rice；the cluster Ⅱ involved upland rice poya and varieties developed by our team. The clustering result of Hainan upland rice varieties showed close genetic relationship among Shanlan upland rice varieties. The Hainan upland rice poya might has some genetic similarities with nonglutinous rice germplasms. In addition, we established the molecular identity card of 28 Hainan upland rice varieties with SRAP markers. All these results provided the basis for the Shanlan upland rice heredity relationship and the Shanlan upland rice germplasm resources’ appraisal and the new variety’s breeding.

Upland rice Shanlan upland rice SRAP markers Genetic diversity Molecular identity card

2014-03-27

海南省自然科学基金项目（808114），海南大学2009科研项目（hd09xm54）

姚宇飞，男，研究方向：作物遗传育种；E-mail：yao_254897312@qq.com

王英，女，博士，副教授,硕士研究生导师，研究方向：作物遗传育种；E-mail：biotechwangying@163.com