马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

平海涛王玉萍王东霞周晓洁

（1.甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学国家重点实验室培育基地，兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070；3. 甘肃农业大学园艺学院，兰州 730070）

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

平海涛1，2王玉萍1，3王东霞1周晓洁1，2

（1.甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学国家重点实验室培育基地，兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070；3. 甘肃农业大学园艺学院，兰州 730070）

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种“大西洋”为试验材料，采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明，该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域，在高等植物中具有高同源性，是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能，分别构建该基因强启动子表达载体（pBI121）和干扰载体（pHANNIBAL和pART27），转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株，同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。

马铃薯 STI-LIKE基因 TPR结构域 株型发育

马铃薯块茎既是无性繁殖的“种子”，也是产量构成和营养储藏器官。块茎形成和发育是马铃薯植株同化产物的利用及地下器官形态建成的复杂过程，不同品种、不同生态环境条件下，块茎形态、营养成分等各方面均表现出差异，成熟块茎大小相差可达到100倍［1］。马铃薯块茎发育是在内源生长调节物质和外部环境因素共同影响下相关基因在发育过程中程序性表达的结果，涉及一系列基因的表达与关闭［2-5］。研究表明，HSP17.7、CONSTANS和CDPK1［6-8］对马铃薯块茎的形成起调控作用。

拟南芥STI-LIKE蛋白含有TPR和STI1结构域。TPR结构域是一个由34个氨基酸重复的串联结构单元，最初是在研究细胞分裂时发现的［9］。TPR结构域包含蛋白参与细胞周期、细胞应激、基因转录、蛋白折叠和蛋白运输等一系列生理生化反应［10-12］。一些TPR结构域包含蛋白可与Hsp90相互作用［13］，起到信号传导作用。TPR结构域介导蛋白的相互作用和蛋白质复合体的组装［14］。STI结构域是热激蛋白结合结构域，存在于蛋白质N末端或C末端，介导蛋白质和HSP蛋白相结合［15］。在高光和热激状态下，拟南芥STI蛋白累积量迅速上升［16，17］。STILIKE同源蛋白STI磷酸化蛋白2C与细胞分裂激酶呈负相关［15］。

在我们前期的研究中发现，STI-LIKE蛋白在马铃薯块茎的发育阶段中表达量呈上升趋势，推测其可能在块茎发育中起关键作用［18］。由于TPR结构域和STI结构域的功能及STI-LIKE蛋白在细胞周期调控中的功能，推测STI-LIKE基因可能参与植株发育过程的调控。本研究通过构建STI-LIKE干扰载体和强启动子表达载体转化模式植物拟南芥，验证其在拟南芥生长发育过程的功能，旨在分析STI-LIKE蛋白在植物发育中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯普通栽培品种“大西洋”和拟南芥（生态型Columbia）由甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室提供。

KOD-Plus高 保 真 酶、Target Clone-Plus- A试剂盒购自东洋纺公司，Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Thermo公司，限制性内切酶购自TaKaRa公司，T载体pMD19-T购自宝生物工程有限公司，pET28原核表达载体购自Novagen公司，pHANNIBAL和pART 27为实验室保存质粒，其他试剂为国产试剂。

1.2 方法

1.2.1 基因的确定 前期在马铃薯块茎发育过程差异蛋白质组研究中发现STI-LIKE蛋白在块茎发育过程中表达丰度上升，可能参与马铃薯块茎的发育［18］。根据NCBI的EST数据库确定了马铃薯STI-LIKE基因的CDS序列。

1.2.2 RNA提取与cDNA合成 按照Trizol试剂盒的方法提取马铃薯块茎总RNA，以总RNA为模板按照Thermo反转录试剂盒的方法反转录合成第一链cDNA。

1.2.3 引物设计与目的基因的克隆

1.2.3.1 引物 利用软件DNAMAN设计引物，由上海生工合成。目的片段扩增引物35sF和35sR；以RNAixbaF、RNAibamhR、RNAixhoF和 RNAikpnR为RNAi片段扩增引物；以antibodyF和antibody为扩增引物制备抗原。

35sF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAGGCCA AAGG，35sR：ttctcgagTTATCTAACTTGCACAATTCCT GC；

RNAixbaF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAibamhR：aaggatccCTGTTGCAAATA ACCCCTTGTACTCG；

RNAixhoF：aactcgagATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAikpnR：aaggtaccCTGTTGCAAATAA CCCCTTGTACTCG；

AntibodyF：aactcgagAAAGATTGTGACACAGCTGTTG，AntibodyR：aaggatccGAGTTCCTGATTCTGAGGATC。

1.2.3.2 STI-LIKE基因目的片段扩增 以反转录合成的cDNA为模板，利用PCR反应合成目的片段。反应体系50 μL、模板2 μL，KOD-plus 0.5 μL、引物（35sF，35sR）各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，水36.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃复性15 s，68℃延伸2.5 min 35个循环。RNAi载体目的片段，抗体目的片段制备PCR延伸时间为1 min，其余反应体系与目的片段扩增一致。扩增片段以1%琼脂糖凝胶电泳检测后测序。

1.2.3.3 STI-LIKE基因生物信息学分析 利用NCBI数据库和该网站提供的blast工具进行同源蛋白比对分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。蛋白质结构域由NCBI网站预测给出，蛋白质三级结构的预测利用蛋白专家系统在线工具（http：//www.expasy.org/）完成。

1.2.3.4 STI-LIKE基因过表达载体的构建 切胶回收全长片段，酶切连接到pBI121。质粒转化大肠杆

菌Top 10，挑取白斑克隆PCR鉴定，酶切验证。

1.2.3.5 STI-LIKE基因RNAi载体构建 以酶Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分别双酶切目的片段。Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分别先后双酶切pHANNIBAL载体，挑取白斑克隆PCR 鉴定。将pHANNIBAL与pART27分别用酶Spe I和Not I双酶切后将pHANNIBAL酶切片段连接到pART27，挑取白斑克隆PCR 鉴定。

1.2.3.6 STI-LIKE基因表达定量分析 分别提取马铃薯块茎、茎、叶、匍匐茎和根的RNA并定量，并使模板浓度一致，进行RT-PCR反应。反应体系，100 ng模板，上下游引物各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.5 μL，水36.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃复性15 s，72℃延伸2.5 min，30个循环。

1.2.3.7 STI-LIKE抗原蛋白表达和纯化 对目的蛋白进行同源比对，预测跨膜结构。选取无跨膜域片段区作为抗体制备的抗原区段。以引物（Antibody和AntibodyR）扩增cDNA，XhoⅠ和BamHⅠ双酶切目的片段与pET28，连接并转化大肠杆菌。挑取白斑克隆PCR 鉴定提质粒，转化大肠杆菌DE3，诱导后蛋白过镍离子亲和交换柱纯化制备抗体。

1.2.4 拟南芥的遗传转化 拟南芥的遗传转化具体方法参照杜培粉［19］进行，以1/2MS+L77培养基重新悬浮利用花药侵染法侵染花蕾两次，收获的拟南芥种子播种于含有50 mg/L卡那霉素的1/2 MS 培养基中，提取12 d 未黄化的幼苗进行检测。

2 结果

2.1 RNA提取与目的基因克隆

马铃薯“大西洋”总RNA提取结果表明RNA（28S、18S、5S）完整无降解。合成总cDNA后稀释100倍，以引物（35sF，35sR）扩增得到目的片段（图1）。

图1 马铃薯总RNA提取及目的基因RT-PCR

2.2 生物信息学分析

同源比对的结果表明STI-LIKE只存在于高等植物中，低等植物中没有同源蛋白（图2）。同源性分析还表明在高等植物中STI-LIKE保守性很高，并且具有3个TPR结构域，其中一个TPR结构域靠近N末端，其它两个靠近C末端（图3）。

图2 马铃薯STI-LIKE蛋白同源性分析

图3 马铃薯STI-LIKE蛋白结构域预测

2.3 STI-LIKE基因过表达载体的构建

将目的片段连到载体后，挑去白斑克隆，酶切检测目的片段（1 700 bp）并利用载体通用引物测序，确定连入的目的片段无错配，转化农杆菌并侵染拟南芥（图4）。

图4 pBI121载体酶切检测

2.4 STI-LIKE基因的RNAi载体的构建

扩增获得两条目的片段（图5-A），分别连接到pHANNIBAL载体。阳性pHANNIBAL载体双酶切后得到大小相近的两个片段（图5-B）。将pHANNIBAL与pART27双酶切连接后，挑取白斑克隆PCR 鉴定（图5-C）。测序结果正确无错配。将质粒转化到农杆菌侵染拟南芥。

图5 STI-LIKE基因干扰载体的构建

2.5 STI-LIKE基因在各器官表达定量分析

定量分析表明，STI-LIKE基因在马铃薯各组织器官（无花器官）中都有表达，其中在根中表达量最低（图6）。

图6 马铃薯各营养器官STI-LIKE基因表达量定量分析

2.6 抗原蛋白表达和纯化

小量诱导（图7-A）表明，IPTG诱导3 h后浓度达到峰值。大量诱导（图7-B）表明，抗原蛋白主要存在于沉淀中。纯化后SDS-PAGE（图7-C）检测，纯化效果理想，用纯化后蛋白制备抗体。

图7 马铃薯STI-LIKE蛋白抗原的小量诱导（A）、大量表达（B）和纯化检测（C）

2.7 转基因拟南芥表型分析及验证

对生长3周的转基因植株观察，结果（图8）发现过表达STI-LIKE基因植株生长和野生型表型相同，而干扰表达STI-LIKE基因植株明显小于野生型

植株。Western blot（图9）检测表明野生型植株与过表达STI-LIKE基因植株的STI-LIKE蛋白表达量无显著差异，而干扰表达STI-LIKE基因植株中STILIKE蛋白表达量显著降低，低于1/2野生型植株表达量。

图8 转STI-LIKE基因拟南芥植株表型分析

图9 转STI-LIKE基因拟南芥植株免疫印迹分析

3 讨论

同源比对的结果表明STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度保守性，同时也说明其可能具有相似的功能［19］。同时STI-LIKE蛋白不具有信号肽并定位于细胞质。3个主要TPR结构域分布在N末端和C末端，表明可能是通过与另外两个蛋白形成一个三亚基复合体蛋白质的形式实现其功能［14］。对马铃薯的根、叶、茎、匍匐茎和块茎中STI-LIKE表达分析表明该基因并不具有严格组织特异性，在马铃薯各器官组织中广泛表达［20］。由此推测该基因对马铃薯块茎发育的影响可能是通过调控共有的代谢通路来影响马铃薯块茎的发育过程。

对转基因拟南芥植株的表型分析是植物基因功能验证模式体系，对过表达和干扰表达转STI-LIKE基因拟南芥植株表型观察表明，过表达STI-LIKE基因对拟南芥发育无显著影响，而干扰表达STI-LIKE基因却能够使拟南芥植株发育过程受阻，又由于STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度同源性，推测STI-LIKE基因在拟南芥和马铃薯中的功能相同［21］，是高等植物生长发育所必须的。本研究为STI-LIKE基因在调节拟南芥植株发育和马铃薯块茎发育的进一步功能验证奠定了基础。

4 结论

参与马铃薯块茎形成的STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域，在高等植物中具有高同源性和保守性，表达不存在组织特异性；过表达STI-LIKE基因对拟南芥发育无影响，干扰表达STI-LIKE基因使拟南芥植株发育受阻，表明STI-LIKE基因为植物发育的必需基因。

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（责任编辑 李楠）

Functions of Potato Tuber Formation-related Gene STI-LIKE in Phenotype of Arabidopsis thaliana

Ping Haitao1，2Wang Yuping1，3Wang Dongxia1Zhou Xiaojie1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070； 3. College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070）

A series of gene’s expression and silencing were involved in potato tuber formation. The full length of potato STI-LIKE gene was cloned by using the RT-PCR（reverse transcription PCR）method from the potato variety “Atlantic”. The expression of STI-LIKE gene in all potato organs were analyses by real time PCR analysis. The results showed that STI-LIKE gene expressed in all potato organs. The bioinformatics analysis indicated that STI-LIKE protein contains three TPR domains, and the STI-LIKE gene was homologous recombination in higher plants. The expression vector（pBI121）and interference vectors（pHANNIBAL and pART27）were constructed and transferred to Arabidopsis thaliana. The STI-LIKE protein expression level was examined by Western blot with specific antibody. The results indicated that STI-LIKE gene might be associated with the growth and development of seedling of Arabidopsis.

Potato STI-LIKE gene TPR domain Phenotype

2014-04-08

国家自然科学基金项目（31060063，31260094），甘肃省自然科学基金项目（0803RJZA0510），甘肃省教育厅高校科研专项（1002-07），甘肃省财政厅高校基本科研业务费

平海涛，男，硕士研究生，研究方向：作物遗传育种；E-mail：pinghaitaopht@163.com

王玉萍，女，副教授，作物遗传育种；E-mail：wangyp@gsau.edu.cn