甘蔗类异黄酮还原酶（IRL）基因的克隆与表达分析

谢晓娜张小秋邵敏朱惠杨丽涛，2李杨瑞，2

（1..广西大学农学院 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；2.中国农业科学院甘蔗研究中心 广西农业科院农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007）

甘蔗类异黄酮还原酶（IRL）基因的克隆与表达分析

谢晓娜1张小秋1邵敏1朱惠1杨丽涛1，2李杨瑞1，2

（1..广西大学农学院 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；2.中国农业科学院甘蔗研究中心 广西农业科院农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007）

采用 RT-PCR 技术从甘蔗中克隆 SoIRL基因，用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析，利用荧光定量PCR 技术研究SoIRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明，克隆获得甘蔗 SoIRL，GenBank 登录号为KF808324。该 cDNA 全长 1 169 bp，含有 1 个 927 bp 的完整开放阅读框（ORF），编码 309个氨基酸。系统进化树分析显示，甘蔗SoIRL 与玉米的 IRL 蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明 SoIRL 在甘蔗根、茎、叶中均有表达；在RSD病菌及低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl 和 脱落酸（ABA）4种非生物胁迫下均被诱导表达，但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程，并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。

甘蔗 类异黄酮还原酶 基因克隆 表达分析

甘蔗是制糖的主要原料，是我国最重要的糖料作物，也是极具潜力的生物质能源作物［1］，甘蔗宿根矮化病（Ratoon stuning disease，RSD）是甘蔗生产中最为严重的细菌病害之一，常导致感病品种新

植蔗减产10%-15%，宿根蔗减产20%-25%，在干旱的情况下感病品种的宿根蔗产量损失可达60%以上［2］，目前有关甘蔗与RSD病原菌互作的分子机制研究不多。类异黄酮还原酶（IRL），是合成木质素和异黄酮等植物次生代谢产物的一类关键酶［3，4］，而木质素、类黄酮和生物碱等次生代谢产物［5］，在植物的生长发育、色素形成、抗毒素的产生等方面都具有重要的作用。自1991年首次从豆科植物克隆得到异黄酮还原酶基因以来，陆续从拟南芥［6］、烟草［7］、葡萄［8］、马铃薯［9］、金荞麦［10］、苦荞［11］、银杏［12］等多种植物中克隆得到IRL基因。目前，对编码甘蔗类异黄酮还原酶基因的研究还未见报道，对于异黄酮还原酶基因与植物抗逆性之间的机理研究也未见报道。本研究利用差异蛋白质组学技术和MALDI-TOF/TOF技术，鉴定出类异黄酮还原酶蛋白，并通过RT-PCR克隆甘蔗SoIRL基因；分析SoIRL基因的相关结构域、序列特征及细胞定位，研究SoIRL基因在甘蔗不同部位及不同逆境下的表达模式，为甘蔗的抗逆尤其是抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料处理与取样：试验于2011年3月至2013年12月在广西大学农学院甘蔗智能温室大棚及广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室完成。

将PCR检测后没有宿根矮化病的甘蔗品种GT11砍成单芽种茎，50℃ 2 h温汤脱菌后，凉至室温。一部分用Lxx菌液浸种，一部分用清水浸种作为对照。将处理后的甘蔗品种的单芽种茎进行桶栽土培。混合土为（土∶有机肥∶沙=7∶2∶1，W/W），并把桶移至智能温室大棚，按照日常管理。待甘蔗长至90、120、150、180 d时分别取蔗茎基部2-3节；取不做任何处理的生长健壮，长势一致的甘蔗单芽种茎种植在细沙中，当苗长出2-3叶时，转移到营养杯（沙∶土=1∶1）中培养。待苗长到 7-8片真叶时，取长势一致的植株，分为4组，进行如下处理，一组用15%的PEG进行浇灌处理；一组 4℃低温处理（白昼 16 h/8 h，湿度 65%）；另外两组分别用 100 mmol/L的 NaCl 和100 μmol/L的 ABA进行喷洒叶面处理。在处理后分别于 0、3、6、12、24和 48 h 取样；另取不做任何处理的健康甘蔗根、茎、叶样品。各处理取样后用液氮速冻，置于-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 双向电泳 RSD菌液浸种为处理，ddH2O浸种为对照，以TCA-丙酮法提取对照与处理蔗汁蛋白质，进行双向电泳，利用BioRad 2-D分析软件找出差异蛋白点，质谱鉴定，登录NCBI数据库，对质谱鉴定结果进行分析。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol试剂提取总RNA（北京康为世纪公司），RNA浓度测定后，将RNA稀释至同一浓度保存待用。应用 M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa）将纯化的总RNA 反转录成第一链 cDNA，逆转录加尾引物为Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具体操作步骤参照说明书进行。

1.2.3 SoIRL基因的克隆与生物信息学分析 以质谱鉴定的 IRL蛋白氨基酸序列为参照，登录NCBI进行搜索，选取同源性较高的植物核苷酸序列，运用Primer软件设计该基因上游引物IRL1：5'-ATGGCGTCGGAGAAGAGCAA-3'，下游引物使用逆转录加尾引物 3side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。SoIRL基因的克隆参照Dream Taq DNA 聚合酶的反应体系及程序，PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳检测，回收纯化目的条带，用pMD18-T连接，挑取阳性克隆，PCR检测后，送去上海生工生物工程公司测序。

用软件 BioXM2.6 预 测 SoIRL 氨 基 酸 序 列；用Protparam分析蛋白质理化性质；用TMpred分析分析SoIRL蛋白的跨膜结构；用ExPASy Proteomics Server软件预测基因的亲疏水性；用SOPMA软件预测基因的二级结构分析；用Motif Scan软件对SoIRL的功能结构域进行预测；采用MEGA 4软件构建甘蔗SoIRL氨基酸序列与其它物种的进化树。

1.2.4 SoIRL基因的实时荧光定量表达分析 根据获得的SoIRL基因序列设计Real-time PCR特异性引物IRL-F：5'-GAGAAGAAGACCGGCAAGAC-3'，IRL-R：5'-GATCGCCAGGATGATATTCAG-3'；以 甘蔗GAPDH基因（登录号为 EF189713）为内参，并设计内参

引物 GAPDH-F：5'-AAGGGTGGTGCCAAGAAGG-3'，GAPDH-R：5'-CAAGGGGAGCAAGGCAGTT-3'。试验在罗氏 480（LC480）荧光定量 PCR 仪上进行，反应总体积为25 μL，反应体系及程序参照 TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书。按照 2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

2 结果

2.1 RSD胁迫下甘蔗蔗汁差异蛋白质双向电泳分析以甘蔗为材料，提取健康与感染RSD的甘蔗蔗汁蛋白，对蛋白质进行等点聚焦和SDS-PAGE电泳分离，利用BioRad 2-D软件进行分析，其中蛋白点12在RSD病原菌胁迫下调表达，被MALDI-TOFTOF/MS鉴定为IRL基因（图1）。

图 1 甘蔗低温胁迫SoIRL蛋白的差异表达

2.2 SoIRL基因的克隆

以cDNA为模板，IRL1和3side为上下游引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳（图2）检测得到一条1 200 bp左右的DNA条带，对目的条带进行回收纯化，连接T载体，转化DH5α，蓝白斑筛选后，测序得到一个1 169 bp的序列。该基因命名为SoIRL，NCBI登录号为KF808324。BioXM2.6 软件分析显示该基因包含启动子 ATG 和终止子TGA，开放阅读框（open read frame，ORF）为927 bp，编码309个氨基酸（图3）。

图 2 甘蔗 SoIRL 的扩增

2.3 SoIRL基因生物信息学分析

用在线软件http：//www.expasy.org/tools/protpara m.htm分析SoIRL的理化性质，显示该基因所编码的氨基酸序列等电点为 5.17，蛋白质分子量大小为 33.00 kD。在氨基酸序列组成中，一些氨基酸如Ala、Leu、Val、Gly 出现频率较高，分别占11.7%、9.4%、9.1%和9.1%，而一些氨基酸如Trp、Met、His 出现频率则较低，只占0.3%、1.0%、1.3%和1.9%，而Sec、Cys 在氨基酸序列中则没有出现。该蛋白质的分子式为C1486H2365N387O453S3，原子总数为4 694，消光系数为23 380，不稳定系数为30.18，是稳定蛋白；脂肪系数为97.25，总平均亲水性为-0.026，该蛋白为亲水蛋白。SOSUI signal软件预测显示SoIRL N端1-24含一个序列长24个氨基酸的信号肽（MASEKSKILVVGGTGYLGRHVVAA）。TMpred软件预测含有7个跨膜螺旋区，3个区为由内向外跨膜，分别分布在15-36、150-169和259-277区域；4个区为由外向内跨膜，位置分别在8-24、7-191、150-168和258-274。氨基酸疏水性最小值为-2.544，最大值为2.478。二级结构预测显示，α-螺旋122个，占39.48%，延伸链54个，占17.48%；β-转角22个，占7.12%；无规则卷曲111个，占35.92%，可见SoIRL蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲组成。该基因含有16个磷酸化位点，Ser 4个、Thr 4个和Tyr 4个，转录后修饰位点的存在，说明转录后修饰对功能性蛋白SoIRL具有重要的作用。

蛋白质功能结构域分析显示含有一个环腺苷酸磷酸化位点为138-141；3个蛋白激酶C磷酸化位点分别为3-5、25-27、235-237；5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点分别为52-55、223-226、229-232、277-

280和299-302；序列132-137、145-150、165-170、286-291为N-肉豆蔻酰化位点；210-213为N-糖基化位点；122-129为依赖于cAMP-cGMP蛋白激酶磷酸化位点；9-29、10-23为NAD辅酶结合位点；两个NmrA（氮代谢抑制调节剂）保守结构域（8-300）。这说明SoIRL很可能为短链脱氢酶家族（SDR）的成员。在NCBI在线软件分析SoIRL极可能为SDR大家族中PCBER家族的一员。

图 3 SoIRL 编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列

甘蔗 SoIRL 的氨基酸序列与其它作物 IRL 编码的氨基酸序列多重比对分析（图4）发现，它们之间有较高的同源性，但也有明显碱基上的差异。通过构建甘蔗和其它植物的IRL进化树（图5），发现甘蔗的 SoIRL 与高粱、玉米、禾草聚为一大类，与玉米的同源性最高为 99%。从进化树上看，相同科或类群的植物聚为一类，但不同植物间 IRL 间也存在很高的同源性，这也可推测其在进化过程中是相当保守的。

2.4 SoIRL基因的表达量分析

提取甘蔗不同组织的RNA，以甘蔗GAPDH基因为内参，进行实时荧光定量PCR分析，结果（图6）表明SoIRL在甘蔗的根、茎、叶中都有表达，为组成型表达，SoIRL基因在+1、+3、+5叶（最高可见肥厚带叶为+1叶，往下以此类推）中的表达量差异不大；在茎中的表达量为第7节间（茎中部）最高，茎基部第1节间次之，在茎尖表达量最小，只有茎中部表达量的1/4；SoIRL在根部也有表达，且表达量与在茎中部及叶中的表达量差异不是很大。

同时采集90、120、150和180 d健康及感染RSD甘蔗蔗茎基部，进行qRT-PCR分析，结果（图7）表明，在感病的蔗茎体内90、120和150 d，So-IRL的表达都高于健康对照，而在180 d则低于健康蔗茎。无论是健康还是感染RSD的蔗茎，SoIRL都表现为先升高后降低的趋势，可见SoIRL在甘蔗体内的表达不是一成不变的，而是随着甘蔗的生长而发生着变化。

图 4 SoIRL与其它植物IRL 氨基酸序列多重比对

图 5 甘蔗 SoIRL 与其它植物 IRL 氨基酸序列的关系分析

在干旱、低温、激素和盐胁迫下 SoIRL 均被诱导表达，但表达模式不一（图 8）。在PEG模拟的干旱胁迫下，SoIRL 出现先下调后上调的表达模式，处理3 h时降到最低仅为对照的一半，之后开始缓慢上升，到48 h时升为对照的1.9倍。在4℃低温胁迫下，SoIRL的表达则出现“抑-扬-抑-扬”的双峰表达模式，3 h时SoIRL的表达量急剧下降，降为对照的3.8%，之后开始缓慢增加，12 h时升到最高为对照的1.83倍，之后又开始有所下降，48 h时又升为对照的1.63倍。ABA处理下SoIRL的表达出现“升-降-升”的表达趋势，处理3 h时表达量有所增

加，之后开始下降，24 h降到最低，仅为对照的37.0%，之后又开始增加，到48 h时表达量还是低于对照。NaCl模拟的高盐胁迫下SoIRL的表达也出现“扬-抑-扬”的表达趋势，在处理3 h时升为对照的2.3倍，之后开始出现急剧下降，12 h降到最低仅为对照的13.0%，之后又开始上升，48 h升到最高为对照的3倍之多。

图6 甘蔗SoIRL的组织特异性表达

图7 健康及感染RSD的甘蔗出苗后90-180 d SoIRL的表达

图 8 SoIRL 在 4 种非生物胁迫条件下的表达特性

3 讨论

类异黄酮还原酶包括异黄酮还原酶（IFR）［13］、落叶松脂醇还原酶（PLR）［14］和苯基香豆满苄醚还原酶（PCBER）［15］，进几年的研究发现IRL与植物中多种抗毒素的合成密切相关，参与了植物对生物和非生物胁迫的应答［4］，在植物的生长发育、抗病、抗逆等方面发挥着重要的作用。

本研究根据已知IRL基因序列设计简并引物，获得甘蔗SoIRL基因的全长序列1 167 bp，序列

分析表明该基因具有完整的开放阅读框，生物信息学分析SoIRL极可能属于短链脱氢酶家族，是NADPH依赖性还原酶，属于PCBER家族成员的一员。这与赵海霞等［11］已报道的苦荞FtIRL 推导的蛋白质含有保守的NADPH 结合位点，符合短链脱氢酶家族的结构特征结论一致。软件预测显示SoIRL N端1-24含一个序列长24个氨基酸的信号肽（MASEKSKILVVGGTGYLGRHVVAA），包含两个NmrA保守结构域，4个N-肉豆蔻酰化位点，一个保守的N-糖基化位点，多个重要的磷酸化位点，这些与已报道的野生金荞麦FcIRL结构相似［10］。同源性分析显示甘蔗SoIRL编码的氨基酸序列与其它物种IRL氨基酸序列具有较高的同源性，进化树分析发现SoIRL与高粱还有玉米的IRL亲缘关系最近，相同科或类群的植物聚为一类，同时发现不同植物间IRL间也有较高的同源性，这说明IRL在进化过程中保持了一定的演化趋同性。

本研究通过 qRT-PCR 分析SoIRL在甘蔗组织中的表达差异，发现SoIRL在甘蔗的根、茎、叶中都有表达，为组成型表达。这与Vander Mijnsbrugge等［16］报道的PCBER在快速生长的植物组织中都能大量表达一致。棉花种皮的PCBER转录水平较高［15］，这在种子发育时起着至关重要的作用，因为它不仅能保护种子的结构不被破坏，而且可以增强棉花抵御外来生物侵染的能力。在RSD病原菌的胁迫下，SoIRL被诱导表达。有研究报道，葡萄的IRL蛋白在抵抗UV射线及病原菌感染时被诱导产生［8］，水稻OsIRL 在稻瘟病病原菌（Magnaporthe grisea）和茉莉酸的诱导下，其表达量上升［18］，咖啡叶中CoIRL在真菌浸染和机械损伤的逆境下，表达量显著上升［3］。本研究还通过 qRT-PCR分析了SoIRL在4种非生物胁迫下的表达情况，结果显示，在PEG、4℃胁迫下SoIRL都表现为先降低后升高的表达模式，都是在处理3 h表达量降到最低点。而在ABA作用下SoIRL出现“扬-抑”的表达模式，3 h时升到最高，24 h降到最低，在NaCl模拟的高盐胁迫下，SoIRL则表现为“扬-抑-扬”的表达模式，48 h表达量升到最高。可见非生物胁迫可以诱导SoIRL的表达，但不同的非生物胁迫表达的模式不尽相同。关于其它植物IRL在不同逆境胁迫下的表达分析也已有报道。在ABA处理下银杏体内的GbIRL出现上调表达，推测可能是通过促进苯丙烷代谢途径从而提高下游代谢水平［12］，柚子IRL基因参与应答紫外辐射［19］，银杏在UV-B照射下，GbIRL1表达量升高，推测可能与异黄酮的积累有关［20］，水稻OsIRL在ABA、SA作用下表达量下调［18］，拟南芥中的IRL基因被氧化胁迫诱导，编码产生相应蛋白［6］，烟草A622基因能够被MeJA诱导表达，但却被乙烯及其类似物所抑制［21］，银杏GbIRL在机械损伤、SA、ABA、ALA诱导下，其表达量上升，在ETH诱导下表达量下降［12］。环境条件会对植物的生长产生各种各样的影响甚至胁迫，为了提高植物对物理环境的适应性，植物一方面在形态结构上发生变化，另一方面在生理生化上发生变化，而一些次生物质则成为后种适应的物质基础。在植物耐旱、抗寒和耐盐性研究中都发现次生代谢产物在其中发挥着重要作用［22］。在干旱胁迫下，植物组织中次生代谢产物的浓度常常上升。由于4℃、PEG、NaCl 等对植物的胁迫与植物遭受寒害、干旱、渗透胁迫的效应类似，因此可以推测 SoIRL在甘蔗抗干旱、抗渗透胁迫或者抗氧化胁迫中发挥某种作用，推测SoIRL基因可能通过调节木质素代谢过程对胁迫产生一定的应急反应或发挥其它作用，但是调控方式和调控程度在不同物种中表现又有所不同，具体作用需通过进一步的试验来探讨。

4 结论

通过研究甘蔗感染RSD后蛋白质组的变化，鉴定并克隆出SoIRL。通过qRT-PCR分析研究了SoIRL在RSD病原菌胁迫、甘蔗不同组织及与 4 种非生物胁迫条件下的表达特性，结果表明该基因在甘蔗体内为组成型表达，其表达受RSD病原菌诱导，并参与了甘蔗应答RSD过程，也受非生物胁迫的诱导，推测其在甘蔗抵抗干旱、低温和高盐等非生物胁迫的逆境中也发挥了重要作用。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Sugarcane Isoflavone Reductaselike（IRL）Gene

Xie Xiaona1Zhang Xiaoqiu1Shao Min1Zhu Hui1Yang Litao1，2Li Yangrui1，2
（1. College of Agriculture，Guangxi University，State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources，Nanning 530004；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of Agriculture，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning 530007）

The SoIRL gene cDNA sequence was cloned from sugarcane variety GT11 using RT-PCR techniques. The bioinformatics methods were used to analyze the putative amino acid sequence, and Real-time PCR method was used to study the expression of SoIRL gene in different tissues and under different stresses. The results showed that the full-length cDNA of SoIRL（GenBank accession number：KF808324）in sugarcane was cloned. The sequence consists of 1 167 bp with an intact open reading frame of 927 bp, encoding a polypeptide of 303 amino acids. Phylogenetic tree analysis indicated that SoIRL was highlg closely related to IRL of Zea mays. Real-time PCR results showed that the SoIRL expressed in root, stalk and leaf. Furthermore, SoIRL transcription level was induced under the treatment of the bacterial of ratoon stuning diaease, low temperature, PEG, NaCl and ABA stresses, but the expression patterns were different. Gene SoIRL was firstly isolated and characterized from sugarcane（GT11）, which may participate in sugarcane resistance to RSD, and also play a role in the sugarcane resistance to chilling, drought and salt stress environments.

Sugarcane SoIRL Gene cloning Expression analysis

2014-03-27

国家”863”计划课题（2013AA102604），国家自然科学基金项目（31360293），国家国际合作项目（2013DFA31600），广西科技合作与交流计划项目（桂科合1347004-2），广西自然科学基金创新团队项目（2011GXNSFF018002），广西自然科学基金项目（2012GXNSFDA053011）

谢晓娜，女，博士研究生，研究方向：作物栽培及生理基础；E-mail：xiaonaxie@163.com

杨丽涛，教授，研究方向：甘蔗生理生化及分子生物学，E-mail：liyr@gxu.edu.cn；李杨瑞，教授，研究方向：甘蔗，E-mail：liyr@gxaas.net