戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育

王义强王启业马国辉林丽云

（1.中南林业科技大学生物技术实验室，长沙 410004；2.经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004；3.国家林业局生物乙醇研究中心，长沙 410004）

戊糖乳杆菌发酵产乳酸及高产菌株诱变选育

王义强1，2，3王启业1马国辉1林丽云1

（1.中南林业科技大学生物技术实验室，长沙 410004；2.经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004；3.国家林业局生物乙醇研究中心，长沙 410004）

戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株，发酵条件优化与高产菌株的选育是提高乳酸产量的重要手段。通过单因素试验、Plackett-Burman设计与响应面试验，对戊糖乳杆菌ATCC 8041产乳酸的发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明，该菌株发酵培养基的最佳组合为葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳发酵条件为37℃、pH6.5、接种量6%、装液量80%。在此优化条件下，该菌株发酵产乳酸为54.12 g/L。进一步以戊糖乳杆菌ATCC 8041为出发菌株，通过原生质体进行紫外诱变，经多重筛选，最终获得一株遗传稳定性好的高产乳酸突变株，命名为戊糖乳杆菌Lactic UVC-02，由中国典型培养物保藏中心保存，注册号为CCTCC M 2013209。该突变株Lactic UVC-02经葡萄糖发酵，乳酸产量达64.17 g/L，比出发菌株ATCC 8041（54.12 g/L）提高18.6%。

戊糖乳杆菌 乳酸发酵 紫外诱变 响应面试验

乳酸（Lactic acid），又名丙醇酸，是一种在人体、动植物、微生物体内普遍存在的有机酸［1］。乳酸及其衍生物可广泛应用于食品、化工、纺织、制革、电子、医药以及农业等诸多领域［2，3］。随着环境污染问题

日益严重，应用新技术开发新型塑料，从而解决传统塑料造成的“白色污染”问题，已成为各国研究的热点［4］。乳酸可聚合生产聚乳酸来制造生物降解塑料、绿色包装材料及农业薄膜。聚乳酸无毒，无刺激性，具有较好的生物相容性和生物降解性。以聚乳酸来加工成塑料可解决日益严重的环境污染问题，引起世界的广泛关注。乳酸的生产方法有酶合成法、化学合成法、微生物发酵法3种［5］。工业化生产多采用前两种方法，但它们目前面临原料来源有限、成本急剧增加的困境，最主要的是生产过程中带来严重的环境污染。因此，通过微生物发酵法生产乳酸将成为未来发展的主要趋势。

目前，能应用到工业生产乳酸的微生物只有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌类［6-8］。利用根霉属的米根霉生产乳酸在国内外研究很多，但其发酵产乳酸存在糖转化率低（理论值75%）、有氧混合发酵成本高和副产物多等不足［5，9］。乳酸细菌能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）发酵产乳酸，糖转化率可达90%以上，且发酵成本低，产物主要为L-型乳酸和D-乳酸混合物［10］。部分乳酸菌甚至可利用木质纤维素的水解产物，如木糖、阿拉伯糖等五碳糖，发酵产生乳酸［11-13］。

传统的乳酸发酵常以粮食作物为底物，不仅浪费粮食，且使乳酸价格高昂。因此，寻找和选育能够利用木质纤维素水解液为原料的高产乳酸菌株迫在眉睫。因传统诱变具有诱变效率高且不易回复突变等特性，工业生产上乳酸菌种的选育多数是以传统的诱变选育为主［14］。戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041不仅能利用六碳糖也能利用五碳糖发酵生产乳酸，是能利用木质纤维素水解液发酵产乳酸的潜力菌株［15］。本研究首次采用紫外线对出发菌株戊糖乳杆菌ATCC 8041原生质体进行诱变处理，期望筛选出高产乳酸突变株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本试验所用的戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041购于美国典型培养物保藏中心。

1.1.2 培养基 MRS肉汤活化培养基：眎蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇酐单油酸1 g/L，柠檬酸铵2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CH3COONa·3H2O 7.73 g/L，Na2HPO4·12H2O 5.04 g/L，H2O 1 000 mL，固体培养基添加15 g/L的琼脂，pH6.5。

发酵培养基：葡萄糖90 g/L，眎蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO330 g/L。

种子培养基（改良的MRS培养基）：眎蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇酐单油酸1 g/L、柠檬酸铵2 g/L、MnS04·H2O 0.05 g/L、三水合乙酸钠7.73 g/L、十二水合磷酸氢二钠5.04 g/L，pH6.5。

斜面培养基：在种子培养基的基础上，添加琼脂20 g/L。

筛选培养基：改良的MRS培养基中加入0.01%溴钾酚绿。

高渗再生培养基：采用双层琼脂法，用0.7 mol/L NaCl配制MRS培养基，上层含2%琼脂，下层含3%的琼脂。

渗透压稳定剂：0.7 mol/L NaCl溶液。

1.2 方法

1.2.1 种子培养 取1 mL MRS肉汤培养基于安瓿管中溶解菌体，稀释后涂布平板，培养3 d；取平板培养菌落接种于含10 mL种子培养基的25 mL试管，37℃静置培养10 h为一级种子液。取1 mL一级种子液接种于含100 mL种子培养基的250 mL锥形瓶，37℃恒温摇床中150 r/min培养10 h后用于试验。

1.2.2 发酵培养基单因素试验 以乳酸产量为考察指标，对发酵培养基中的7个组分：葡萄糖（60、75、90、105、120和135 g/L）、蛋白胨（0、5、10、15和20 g/L）、酵母粉（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、Na2HPO4·12H2O（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、MgSO4（0、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 g/L）、MnSO4·H2O（0、25、50、75和100 mg/L）、CaCO3（0、10、20、30、40、50和60 g/L）进行单因素试验，除目标因素外，其余培养基组分均按发酵培养基和已筛选因素中的较佳条件进行试验，每组3个平行，37℃厌氧发酵72 h，液相色谱检测产物，结果取平均值。

1.2.3 Plackett-Burman试验设计与响应面试验 在

单因素试验的基础上确定低水平（-1）值，高水平（1）为低水平的1.25倍，选取影响乳酸产量较大的7个因素（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na2HPO4、MgSO4、MnSO4、CaCO3）进行全面考察，选用N=12的PB设计，以乳酸产量（Y）为响应值，利用试验设计和数据分析软件Minitab15进行Plackett-Burman设计［16，17］，根据软件给出的试验矩阵表确定各试验组的编码与取值进行试验，再根据试验结果进行数据分析，筛选出重要影响因素。

根据Plackett-Burman设计试验结果，采用Box-Behnken设计进行试验［18，19］，所得结果利用软件以乳酸产量（Y）为响应值做响应面分析，从而获得培养基中重要因子的最佳组合。

1.2.4 发酵条件单因素试验 在发酵培养基优化的基础上，以乳酸产量为考察指标，分别对温度（31、33、35、37、39、41和43℃）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6、6.5和7.0）、种子液接种量（2%、4%、6%、8%、10%和12%）及100 mL发酵瓶装液量（65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%） 依次进行单因素试验。除目标因素外，其余培养条件按已筛选的最佳条件进行试验，每组3个平行，进行厌氧发酵，液相色谱检测，结果取平均值。

1.2.5 原生质体制备 取10 mL液体种子培养物于灭过菌的离心管中，4 000 r/min 离心15 min，去上清液，用无菌生理盐水洗涤收集的菌体两次，加入3 mL含溶菌酶的渗透压稳定剂中，将制备的菌酶混合液在30℃的条件下酶解2 h，将酶解液3 000 r/min离心15 min，取上清液收集原生质体，将原生质体悬浮于10 mL渗透压稳定剂中备用。

1.2.6 原生质体紫外诱变 取5 mL经高渗溶液稀释后原生质体溶液，混匀，倒入直径9 mm的培养皿中，在磁力搅拌下距功率20 W的紫外灯35 cm处进行0、20、40、60、80、100和120 s紫外照射。诱变结束后，取不同时间的处理液100 μL涂布在高渗再生培养基上，每个处理3个重复，37℃条件下恒温避光培养72 h。以时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死曲线。致死率（%）=（对照1 mL菌液中活菌数-处理后1 mL菌液中活菌数）/对照1 mL菌液中活菌数×100%。

1.2.7 高产突变株的筛选 将最佳处理原生质体稀释涂布于原生质体再生培养基上，72 h后用无菌牙签将菌落转接在筛选培养基平板上。2 d后培养基为绿色，菌株的代谢产物乳酸会使菌落周围pH降低，形成黄色显色圈，挑取显色圈较大的90株菌株进行摇瓶发酵，每个菌株接1瓶，37℃培养，72 h后测其乳酸产量。得到乳酸产量较高的菌株再次进行发酵复筛，每株3瓶，37℃培养，72 h后测其乳酸产量。

1.2.8 高产突变株遗传稳定性试验 对筛选获得的高活性的突变株进行继代培养，连续继代8次，每代5个平行，测其乳酸产量，分析其稳定性。

1.2.9 乳酸的液相色谱法检测

1.2.9.1 采用液相色谱［20］测定发酵液中乳酸的含量 色谱条件：色谱仪为安捷伦1100［含在线脱气机，可变波长检测器（VWD），agilent 1100四元泵］，色谱柱为EDipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm 1.d. 5 μm），流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液，pH2.5（用NaOH调节），流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，进样量20 μm，柱温为室温。

1.2.9.2 流动相配制 0.27 mL分析纯浓硫酸用水稀释并定容至1 000 mL（0.005 mol/L），用NaOH溶液调节pH值至2.5，然后用0.45 μm孔径的合成纤维素酯膜过滤。

1.2.9.3 对照品制备及标准曲线绘制 精密称取乳酸1 g标准品放入10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至10 mL，配成乳酸标准液，然后进行稀释，分别配成0.5、1、2、4和5 g/L的标准溶液。用0.45 μm孔径的合成纤维素酯膜过滤。再分别经液相色谱检测，以浓度为横坐标，峰高值为纵坐标，绘制出的标准曲线如图1所示。

图1 乳酸标准曲线

1.2.9.4 样品的制备 取5 mL发酵液（5 000 r/min，10 min）除去碳酸钙，加5 mL 0.01 mol/L的硫酸溶

液进行酸解10 min，离心除去硫酸钙，以0.45 μm的滤膜过滤，取1 mL滤液适量稀释即得待测液。

2 结果

2.1 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳发酵培养基确定

发酵培养基中的7个因素的单因素试验结果为葡萄糖90 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO4·H2O 50 mg/L、CaCO330 g/L时对戊糖乳杆菌 ATCC8041发酵产乳酸的影响较大。在此基础上，选取这7个对乳酸产量影响较明显的因素进行Plackett-Burman设计试验（表1），得到了2个对乳酸产量影响显著的因素：葡萄糖质量浓度和酵母粉质量浓度，结果见图2。在此基础上对葡萄糖、酵母浸粉以及第三影响因子CaCO3做响应面试验（表2），得到了预测乳酸产量的模型：

Y=54.00+1.62X1+0.33X2-0.020X3-0.075X1X2-0.020X1X3+0.020X2X3-2.58X12-0.79X22-0.22X32

其中X1为葡萄糖质量浓度，X2为酵母浸粉质量浓度，X3为CaCO3质量浓度。

对该模型进行方差分析和显著性检验（表3）得出，葡萄糖质量浓度、酵母浸粉质量浓度两个因素对乳酸产量影响均达到显著水平。各因素影响乳酸产量的大小顺序为：葡萄糖＞酵母浸粉＞CaCO3。二次回归模型的R2为0.9997，方程P值＜0.05，失拟检验P值为0.2500＞0.05，失拟不显著，试验结果可靠。因此模型选择正确，可用于预测乳酸产量。

Design-Expert软件预测和验证试验表明，发酵培养基的最佳组合为：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L。

2.2 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳发酵条件的确定

在发酵培养基优化的基础上，对发酵条件做单因素试验，结果（图3-图7）显示，得到较佳发酵条件为：温度37℃、初始pH6.5、接种量6%、装液量80%。在培养基与发酵条件优化的基础上，得到出发菌株发酵葡萄糖产乳酸产量为54.11 g/L。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果

图2 七个因素的效应Pareto图分析

表2 响应面试验设计及结果

2.3 戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳诱变剂量的确定

戊糖乳杆菌ATCC 8041最佳紫外诱变剂量的确定结果（图7）显示，随着紫外照射时间的增加，菌体的致死率有逐渐增加的趋势。当照射时间为40

s时，菌体的致死率为85.54%，而60 s时紫外照射的致死率为97.84%。研究表明，当致死率为80%-90%之间时，菌体的诱变效果和生存能力的比例最好，从而确定在功率20 W的紫外灯，距离35 cm照射条件下，最佳诱变剂量为40 s。

表3 方差分析及显著性检验

图3 温度对乳酸产量的影响

图4 初始pH对乳酸产量的影响

图5 接种量对乳酸产量的影响

图6 装液量对乳酸产量的影响

图7 Lactobacillus pentosus ATCC 8041紫外致死率曲线

2.4 高产乳酸突变株的选育

出发菌株经紫外诱变后经筛选培养基初筛，观察筛选平板，正常产酸菌落会产生黄色显色圈（图

8-B），挑取黄色较深的90株菌落进行复筛，结果（表4）显示，紫外诱变后正突变为32.22%，负突变为28.89%，38.89%的菌株没有明显差异。在正突变菌株中，平均产量提高幅度为7.4%，最大产量提高率达到18.84%。进一步对正突变菌株进行摇瓶发酵测乳酸产量进行再复筛，结果（表5）显示，经过再次复筛，突变株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05产量较对照高15%以上。故对突变株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05进行传代培养，检验其遗传稳定性。

图8 出发菌株和突变株菌落形态

表 4 出发菌株紫外诱变结果

表5 突变株发酵复筛结果

2.5 突变菌株的遗传稳定性

将突变株Lactic UVC-02进行传代培养，传代8次，测定其乳酸产量（每代重复5次）如表6所示。进一步对数据进行方差分析，结果见表6。由方差分析可以看出，F crit=2.31是α=0.05的F统计量临界值，F=1.58是F统计量的计算值，1.58＜2.31，P=0.177，故数据间无显著差异，说明突变株Lactic UVC-02遗传稳定性好。

表6 突变株Lactic UVC-02遗传稳定性及方差分析

将突变株Lactic UVD-05进行传代培养，传代8次，其乳酸产量如表7所示（每代重复5次）。对数据进行方差分析，见表7。由方差分析可以看出，F crit=2.31，是α=0.05的F统计量临界值，F=4.64是F统计量的计算值，4.64＞2.31，P=0.001，数据间差异显著，说明突变株Lactic UVD-05的遗传稳定性差。

表7 突变株Lactic UVD-05遗传稳定性及方差分析

通过对突变株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05的遗传稳定性比较表明，Lactic UVC-02的稳定性

优于Lactic UVD-05，故确定突变株Lactic UVC-02为一株高产乳酸突变株，命名为戊糖乳杆菌Lactic UVC-02，由中国典型培养物保藏中心保存，注册号为CCTCC M 2013209。该突变株Lactic UVC-02经葡萄糖发酵后，乳酸产量达到64.17 g/L，比出发菌株（54.12 g/L）提高18.6%，为进一步利用木质纤维发酵产乳酸提供了研究基础。

3 讨论

在发酵工业中，发酵培养基的优化对发酵水平的提高有着重大作用，而合理的试验设计及统计方法的选择在探索最佳发酵培养基的过程中尤为重要［19］。Plackett-Burman（P-B）法是一种以不完全平衡块为原理的试验设计，它能够从众多的过程变量中快速、有效地筛选出最为重要的几个因素，为进一步研究提供基础。响应面分析法是1951年Box Wilson开发的用于研究多因子系统中因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件，结合数学方法和统计分析，通过对重要因子响应过程变量进行数学建模分析，定向优化响应因子［21］。国内外很多学者通过P-B设计和响应面分析法在乳酸发酵培养基优化方面取得了很好的成就［22-27］。本研究通过P-B设计快速有效地从7个影响乳酸产量的发酵培养基组分中筛选出3个显著性影响组分：葡萄糖、酵母浸粉和碳酸钙，然后利用响应面分析法中Box-Behnken设计得出最佳培养基组合：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO450 mg/L。在最佳培养基组合下，乳酸产量达到54.11 g/L，与预测值拟合较好。说明运用响应面法优化戊糖乳杆菌ATCC8041发酵产乳酸是合理可靠的。

微生物诱变育种是指利用各种诱变剂处理微生物细胞，以提高其基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法，诱变育种的速度快、成本低、耗时短、方法简便，是一种高效的菌株选育方法。其中的紫外线辐射方法更具有操作简便，经济实惠，对实验室条件要求低，且出现正突变的几率较高，诱变的效果好，是一种非常实用的诱变剂［28］。在微生物发酵产乳酸方面，利用紫外诱变筛选优良菌株也取得了良好的效果。仲松等［29］以干酪乳杆菌ZZ-L为出发菌株，对其原生质体进行紫外诱变，筛选得到一株比原始菌株乳酸产量高20.7%的高产突变菌株ZZ-06。吴慧昊等［30］使用紫外照射和亚硝基胍复合诱变的方法选育出一株在低温下生长良好、遗传性状稳定的菌株Q1-4-6。Yin等［31］采用紫外和亚硝基胍复合诱变的方法得到突变株Rhizopus oryzae LA-UN-1，乳酸产量达到59.5 g/L，比原始菌株提高54.5%。本研究以能同时利用六碳糖和五碳糖的戊糖乳杆菌ATCC 8041为出发菌，制备了原生质体，并对其原生质体悬液进行紫外诱变，期望获得能利用木质纤维水解液发酵产乳酸的高产突变株。突变体经过初筛、复筛等一系列过程筛选出乳酸产量较高的2个菌株：Lactic UVC-02与Lactic UVD-05，对其进行了8代继代培养检测其遗传稳定性，其中突变株Lactic UVC-02遗传稳定性较好，各代之间无显著差异。突变株菌落形态与原始菌株也出现一定程度的差异，引起这种差异的原因还需进一步在分子水平进行分析研究。由于木质纤维原材料处理过程复杂且周期较长，目前我们已初步得出突变株Lactic UVC-02能利用杨木水解液发酵产乳酸，但暂时还未能完全验证该突变株是否能高效利用木质纤维水解液发酵产乳酸，这也是我们下一步工作的研究重点。

4 结论

戊糖乳杆菌ATCC 8041发酵产乳酸的最佳发酵培养基和发酵条件组合为：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸钙29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳发酵条件为温度37℃、pH6.5、接种量6%、装液量80%。进一步对戊糖乳杆菌ATCC8041进行原生质体诱变得到高产突变株Lactic UVC-02，保存在中国典型培养物保藏中心（注册号：CCTCC M 2013209），其乳酸产量达到64.17 g/L，比原始菌株产量提高了18.6%。

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（责任编辑 马鑫）

Lactobacillus pentosus Fermentation Lactic Acid Production and High Yield Strain Mutation Breeding

Wang Yiqiang1，2，3Wang Qiye1Ma Guohui1Lin Liyun1
（1. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education，Changsha 410004；3. Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration，Changsha 410004）

Lactobacillus pentosus is a potential strain which can make use of the lignocellulose hydrolysate fermentation to produce lactic acid, optimization of fermentation conditions and the breeding of high yield strain are the important means to improve lactic acid production. Fermentation medium and fermentation conditions were optimized for strain Lactobacillus pentosus ATCC 8041, through single factor experiment, Plackett-Burman design and response surface experiment. The results showed that the best combination of fermentation medium is 93.11 g/L glucose, 5.19 g/L yeast powder, 29.43 g/L calcium carbonate, 10.00 g/L peptone, 5.00 g/L Na2HPO4·12H2O, 0.20 g/L MgSO4, 50 mg/L MnSO4. The best fermentation conditions is temperature 37℃, pH6.5, quantity of 6%, and fluid amount 80%. The lactic acid production is 54.12 g/L under the optimized fermentation medium and fermentation conditions. And then, Lactobacillus pentosus ATCC 8041 was taken as the original strain, treated with UV mutation ATCC 8041 protoplast, after through multiple screening, finally we have got a mutant which has high lactic acid production, named Lactobacillus pentosus lactic UVC-02 which conserved in China Center for Type Culture Collection, registration number for CCTCC M 2013209. The results for glucose fermentation showed that lactic UVC-02 produced 64.17 g/L lactic acid, which was 18.6% higher than the original strain.

Lactobacillus pentosus Lactic acid fermentation UV mutation Response surface experiment

2014-03-27

国家林业局“948“项目（2011-4-13）

王义强，男，教授，博士生导师，研究方向：细胞工程与生物能源；E-mail：wangyiqiang12@163.com