重组酵母产人IFN-α2a与LL-37融合蛋白的工艺优化

张明杰

（广东紫金正天药业有限公司，河源 517000）

重组酵母产人IFN-α2a与LL-37融合蛋白的工艺优化

张明杰

（广东紫金正天药业有限公司，河源 517000）

通过单因素试验探索重组酵母P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳条件。结果显示，重组酵母菌产蛋白酶的最佳表达条件是利用BMMY为诱导培养基，以接种量OD600=5.5、温度26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔24 h添加1.0%、振荡速度为200 r/min条件下连续诱导144 h。在最佳培养条件下，发酵液中的LL-37最高抗菌活性达27.9 mm。与初始的发酵条件相比，人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的产量提高了32.29%。

干扰素α2a LL-37 工艺

英国科学家Isaacs和Lindenmann于1957年发现一种能干扰病毒感染的细胞因子，命名为干扰素［1］。随着人类研究的深入，不断发现了许多新的干扰素分子。目前，人类在哺乳动物中发现的干扰素共有10个家族，其中人干扰素有7个家族。按其功能和作用方式，可将人干扰素细分为I型、II型和III型。I型包括α、β、ε、τ、ω、κ，具有抗病毒和抗肿瘤的功能；II 型包括γ，具有调节免疫的功能［2］；III型为干扰素样蛋白，功能与I型类似，但受体不同［3］。人IFN-α2a是由165个氨基酸残基构成，具有防治病毒性疾病［4］和恶性肿瘤［5］的功能。LL-37是目前在人体内发现的抗菌肽Cathelicedin家族中唯一的成员，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较广谱的抗性［6］。除此之外，LL-37还具有免疫调节作用，可趋化单核细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和肥大细胞等［7］。当人体受到病原微生物、炎症或创伤刺激，LL-37的表达水平就会上升［8］。动物试验表明，LL-37可明显降低铜绿假单胞菌感染小鼠的死亡率［2］。

将人LL-37基因与IFN-α2a融合表达，形成同时具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌的三重功效的新功能蛋白，在一些特殊的临床治疗中存在潜在的市场需求。本课题组前期的工作实现了在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115表达三功能的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白。在进入工业化生产之前，有必要建立所构建的基因工程菌工艺条件，并对产品的应用

性能进行验证。本研究通过单因素试验旨在探索重组酵母P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 P. pastoris GS115LI，表达人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白。大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922，用于检测融合蛋白的抗菌活性。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 YPD培养基 酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，121℃灭菌30 min。

1.1.2.2 BMGY培养基 见参考文献［10］。

1.1.2.3 BMMY培养基 同BMGY培养基，仅将其中的甘油10 mL换为甲醇5 mL。

1.1.2.4 初始培养基 种子培养：保藏的菌种先经YPD活化，后将入BMGY培养基，接种量2%，后振荡培养。培养条件：温度28℃，转速200 r/min，培养时间24 h。

诱导培养：种子培养液离心去培养液，后接种入BMMY培养液，使酵母OD600值达6.0，在温度28℃与转速150 r/min下振荡培养，每24 h补充甲醇0.5%（体积比）诱导表达［11］，重复诱导5次。

1.2 方法

1.2.1 单因素发酵试验

1.2.1.1 诱导时长对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 按出发条件进行诱导，诱导过程中每12 h取样分析发酵液抗菌活性，直至检测的抗菌活性不再上升。

1.2.1.2 接种量对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 按前述确定的最佳诱导时长，分别调节接种量以OD600计为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，其它条件不变。诱导完成后取发酵液分析抗菌活性。

1.2.1.3 温度对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 在出发条件的基础上，按前述确定的最佳诱导时间与接种量，改变诱导温度，分别置于24℃、26℃、28℃、30℃和32℃下振荡培养。培养完后取样检测产物的抗菌活性。

1.2.1.4 溶氧对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 通过改变摇床的转速探索溶氧对重组P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响。分别选择摇床转速为120、160、240和280 r/min进行诱导培养，其它条件参照前述选择的最佳条件。诱导结束后取发酵液分析抗菌活性。

1.2.1.5 诱导剂（甲醇）添加量对P. pastoris GS115-LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 通过改变诱导剂甲醇的添加量分别对体积比为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的菌株进行诱导表达。其它诱导条件为前述所确定的最佳条件。诱导结束后取发酵液分析抗菌活性。

1.2.1.6 pH对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响 为了探索pH对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响，分别选择pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0进行试验。其它发酵条件为前述优化的最佳条件。诱导结束后取发酵液分析抗菌活性。

1.2.2 验证试验 在上述确定的最适培养和诱导表达条件下，重复试验3次，进行验证。

1.2.3 发酵液中人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的抗菌活性分析 培养液中LL-37的活性测定参照文献［5］。用E. coli ATCC 25922作为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3 mm的圆孔，每孔加10 μL发酵液，37℃孵化3 h后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养20 h，测量无菌生长的透明圈直径。

2 结果

2.1 诱导时长的影响

诱导时长对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图1）显示，诱导开始后的前24 h，发酵液中检测出的以抗菌活性表示的融合蛋白产量上升较慢，这可能与菌体本身处于环境适应期的延迟期有关；而后产量呈直线上升，至第132 h，此后产量缓慢上升，至144 h达到最大值25.3 mm；此后24 h的诱导期内，融合蛋白产量出现轻微下降，可能是由于宿主老化后，产品有所降解引起。根据以上试验结果，确定144 h为最佳诱导时长。

图1 诱导时长对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.2 接种量的影响

接种量对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图2）显示，随着接种量自OD600=3.5上升，在其它条件不变的情况下，发酵液中以LL-37抗菌活性表示的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白逐渐上升，至接种量达到OD600=5.5后，达到最大值约26.0 mm；之后，呈现逐渐下降的趋势。这表明，当OD600＜5.5，发酵液中的酵母浓度太少，导致表达能力低。在OD600=5.5时达到饱和。之后再升高酵母浓度，可能由于营养或溶氧供应受限，从而导致产物的合成能力不升反降。在此，选择接种量为OD600≈5.5作为最佳的接种条件。

图2 接种量对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.3 温度的影响

温度对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图3）显示，在温度为26℃时，以抗菌活性表示的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白产量最高，可达26.5 mm以上。温度低于26℃，产量会有所下降，可能与低温下酵母代谢活性受影响有关。温度高于26℃，产量也出现下降，可能与在温度高时，酵母自身代谢加快后，衰老同样加快的原因。综合上述情况，选择26℃作为诱导时的最佳温度条件。

图3 温度对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.4 溶氧的影响

在摇瓶阶段，溶氧难以直接测定，故只能采用以摇床振荡转速为依据来进行探索。溶氧对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图4）显示，在振荡转速低于200 r/min时，由于溶氧处于受限状态，故以抗菌活性表示的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白产量较低。振荡转速高于200 r/min后，产量不再继续上升，表明此阶段溶氧已经到达饱和。综合考虑效应与成本，选择200 r/min作为诱导表达时最佳的溶氧控制条件。

图4 溶氧对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.5 诱导剂（甲醇）添加量的影响

诱导剂（甲醇）添加量对P. pastoris GS115LI产

人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图5）显示，甲醇浓度添加量为1.0%（以体积比计，下同）时，以抗菌活性计的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白表达量达最大，约为27 mm。低于1.0%，可能是由于诱导的强度不够，表达速度下降，致使产物产量下降。高于1.0%，可能是由于诱导强度太大，超出了宿主菌的代谢负荷，反而产生负作用，从而也使表达量下降。综合考虑选择1.0%为诱导的最佳甲醇用量。

图5 甲醇添加量对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.6 pH的影响

pH对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响结果（图6）显示，试验条件下，pH6.0时人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的表达量最高，达到27.5 mm以上。pH主要通过影响细胞膜及基质的带电状态，从而影响膜对基质的通透性，再传递到对产物产量的影响。酵母的最适生长pH为偏酸性的环境，此处产物最佳表达量所需的pH6.0，恰好可在不影响宿主本身生长条件下实现产物的最佳表达，故确定pH6.0为最佳条件。

图6 pH对P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的影响

2.7 最佳工作条件验证

根据前面的试验结果，确定P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳工艺条件为利用BMMY培养基，接种量以OD600计为5.5、温度26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔24 h添加1%、振荡速度为200 r/min条件下连续诱导144 h。在该工艺条件下重复验证3次，得到结果（以LL-37抗菌活性计）分别为27.8、28.1和27.9 mm，平均值为27.93±0.12（mm）。该结果与出发培养条件下的表达量（21.1 mm，参考1.2.1.1诱导时间120 h时的结果）相比，产物产量提高了32.39%。

3 讨论

LL-37作为人源性抗菌肽，已经在临床上获得广泛的应用。由于其分子小，与其它蛋白多肽或蛋白类药物融合表达时，不易对与其融合蛋白的功能产生影响，因此将LL-37与其它蛋白融合表达生产多功能药物成为可能［13］。例如，将LL-37与人酸性成纤维细胞生长因子融合表达形成的新蛋白，既具有酸性成纤维细胞生长因子促进伤口愈合的功能，又具有防止伤口感染的功能［14］。受此思路的启发，将LL-37与人IFN-α2a融合表达，构建出了同时具有抗癌、抗病毒和抗菌的三效药物。发酵工艺是将构建的蛋白转化为产物的关键。

从单因素试验的各因素变化所引起的人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白表达水平的波动情况分析，接种量、时间和pH是3个较为敏感的量，其它属于次敏感量，这可能预示着这些因素对表达产量的关键程度。接种量主要影响发酵时延迟期的长短和菌体与营养之间的协调关系。接种量小，延迟期长，产物合成量低；接种量大，菌体浓度高，会引起营养竞争［15］。pH不仅影响宿主菌对外源基因的表达，同时也可能对产物的稳定性及活性产生影响［16］。适宜的培养条件，有利于提高细胞的相对活性和延长细胞的高相对活性状态，从而实现融合蛋白产量的最大化累积［17，18］。各因素之间的影响还需要通过正交试验或序贯试验设计，利用统计学的原理进行详细分析。

试验中为了操作的方便，仅以LL-37的抗菌

活性进行表征。经过在菌种构建阶段的试验确认，LL-37的抗菌活性检测与IFN-α2a干扰素活性检测结果是相一致的，表明二者既实现了融合，而且融合蛋白还同时保留了二者各自独立时的活性（结果发表在本课题组另一篇文章中）。

本试验所有数据均是建立在摇瓶的试验基础之上的。众所周知，摇瓶并不能真正代替发酵罐的生产，因此本试验的结果还只能是发酵生产的参考。在达到生产水平之前，还需通过小型发酵罐进一步优化工艺参数，再逐步放大至生产规模。

4 结论

本研究确定了重组毕赤酵母P. pastoris GS115LI产人LL-37基因与IFN-α2a融合蛋白的最佳工艺条件为利用BMMY培养基、接种量以OD600=5.5、温度26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔24 h添加1%、振荡速度为200 r/min条件下连续诱导144 h。与出发条件相比，产量提高了32.29%。

［1］Borden EC, Sen GC, Uze G, et al. Interferons at age 50：past, current and future impact on biomedicine［J］. Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6（12）：975-990.

［2］Pestka S. The interferons：50 years after their discovery, there is much more to learn［J］. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282（28）：20047-20051.

［3］O' Brien TR. Interferon-alfa, interferon-lambda and hepatitis C［J］. Nat Genet, 2009, 41（10）：1048-1050.

［4］Beilharz MW, Cummins JM, Bennett AL. Protection from lethal influenza virus challenge by oral type 1 interferon［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 355（3）：740-744.

［5］Bodaghi B, Gendron G, Wechsler B, et al. Efficacy of interferon alpha in the treatment of refractory and sight threatening uveitis：a retrospective monocentric study of 45 patients［J］. British Journal of Ophthalmology, 2007, 91（3）：335-339.

［6］Chen X, Niyonsaba F, Ushio H, et al. Synergistic effect of antibacterial agents human β-defensins, cathelicidin LL-37 and lysozyme against Staphylococcus aureus and Escherichia coli［J］. Journal of Dermatological Science, 2005, 40（2）：123-132.

［7］Mookherjee N, Lippert DND, Hamill P, et al. Intracellular receptor for human host defense peptide LL-37 in monocytes［J］. The Journal of Immunology, 2009, 183（4）：2688-2696.

［8］Kai-Larsen Y, Agerberth B. The role of the multifunctional peptide LL-37 in host defense［J］. Frontiers in Bioscience：A Journal and Virtual Library, 2007, 13：3760-3767.

［9］Jacobsen F, Mittler D, Hirsch T, et al. Transient cutaneous adenoviral gene therapy with human host defense peptide hCAP-18/ LL-37 is effective for the treatment of burn wound infections［J］. Gene Therapy, 2005, 12（20）：1494-1502.

［10］柯野, 罗晓春, 谢明权.米曲碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性研究［J］.华南理工大学学报：自然科学版, 2012, 40（8）：40-45.

［11］汤鸣强, 薛盛果, 叶鹏.米曲霉F-81产中性蛋白酶的固定化条件及其特性［J］.生物技术通报, 2012（3）：159-165.

［12］杨云霞, 朱玲, 王伯瑶, 等.人抗菌肽LL-37突变分子的特性和抗菌能力的比较.华西药学杂志, 2006, 21（5）：422-424.

［13］Dannehl C, Gutsmann T, Brezesinski G. Surface activity and structures of two fragments of the human antimicrobial LL-37［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2013, 109：129-135.

［14］Shen J, Lu X, Jin X, et al. Expression of a novel dual-functional protein-The antimicrobial peptide LL-37 fused with human acidic fibroblast growth factor in Escherichia coli［J］. Protein Expression and Purification, 2012, 81（1）：119-125.

［15］Charoenrat T, Khumruaengsri N, Promdonkoy P, et al. Improvement of recombinant endoglucanase produced in Pichia pastoris KM71 through the use of synthetic medium for inoculum and pH control of proteolysis［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 116（2）：193-198.

［16］Reinholz M, Ruzicka T, Schauber J. Cathelicidin LL-37：an antimicrobial peptide with a role in inflammatory skin disease［J］. Annals of Dermatology, 2012, 24（2）：126-135.

［17］Potvin G, Ahmad A, Zhang Z. Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production in Pichia pastoris：A review［J］. Biochemical Engineering Journal, 2012, 64：91-105.

［18］Lo TM, Teo WS, Ling H, et al. Microbial engineering strategies to improve cell viability for biochemical production［J］. Biotechnology Advances, 2013, 31（6）：903-914.

（责任编辑 马鑫）

The Process Optimization of Pichia pastoris GS115LI for Producing Fused Protein of LL-37 and IFN-α2a

Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）

With experiments of single factor, the optimal process of recombinant P. pastoris GS115LI for producing fused protein of LL-37 and IFN-α2a were using BMMY as inducing medium, inoculum as OD600=5.5, temperature as 26℃, pH6.0, inducing chemical（methanol）adding amount as 1.0% every 24 h, incubating shaking speed as 200 r/min, and inducing time as 144 h. Under those optimal conditions, the 27.9 mm of LL-37 antimicrobial activity could be gotten. Compared with the original conditions, the productivity of fused protein of LL-37 and IFN-α2a was increased as 32.29%.

Interferon-α2a LL-37 Fermentation process

2014-03-18

广东省重大科技专项（2011A080502011）

张明杰，教授，研究方向：微生物工程技术；E-mail：mingjiezh@126.com