人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

武建伟 才蕾 王继华 唐时幸

（广州万孚生物技术股份有限公司 自检型快速诊断国家地方联合工程实验室，广州 510663）

人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

武建伟 才蕾 王继华 唐时幸

（广州万孚生物技术股份有限公司 自检型快速诊断国家地方联合工程实验室，广州 510663）

以人源纤维蛋白原为原材料制备D-二聚体，将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纤维蛋白原，获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质，可获得较高纯度的D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案，将D-二聚体制备成冻干品。经检测可知，D-二聚体冻干品可在37℃稳定保存12 d；复溶后在25℃稳定保存8 d；复溶后在4℃稳定保存30 d；复溶时，常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。

纤维蛋白 纤维蛋白原 D-二聚体 血栓 冻干品

D-二聚体（D-dimer）是交联纤维蛋白发生纤溶的特异性标志物，由纤维蛋白原逐步水解而成［1］。纤维蛋白原是一种具有凝血功能的血浆球蛋白，主要作为凝血因子I参与体内凝血过程［2］。经凝血酶、Factor XIIIa作用，纤维蛋白原被水解成交联纤维蛋白；纤溶酶可使纤维蛋白（原）D-E区互补结构裂解，降解纤维蛋白原和纤维蛋白单体生成纤维蛋白原降解产物，以及降解交联纤维蛋白生成纤维蛋白降解产物，纤维蛋白降解产物中含有大量的D-dimer［3，4］。D-dimer分子量约为180 kD［5］，在健康人体内含量极少，一般认定0.5 mg/L（FEU）为cut-off值［6］。另有研究表明，D-dimer的cut-off值与年龄呈正相关，年龄愈大，cut-off值愈高［7］。

机体内凝血和继发性纤溶系统的激活，均可使D-dimer水平升高［8］。临床诊断中，D-dimer检测常用于：静脉血栓栓塞（Venous thrombus embolism，VTE）、深静脉血栓（Deep vein thrombosis，DVT）和肺血栓（Pulmonary embolism，PE）的排除，以及弥漫性血管内凝血（Disseminated intravascular coagulation，DIC）的诊断、溶栓治疗的监测［9-12］；

急性心肌梗塞（Acute myocardial infarction，AMI）、冠状动脉缺血（Coronary ischemia）、脑梗塞（Cerebral infarction）［12-14］的诊断和预后判断；恶性肿瘤，如肺癌（Lung cancer）、卵巢癌、结肠直肠癌（Colorectal cancer）、乳腺癌（Breast cancer）［15-18］，以及肝脏疾病［19］、糖尿病［20］、妊娠高血压综合征高凝状态［21］等的诊断和预后判断。

真空冷冻干燥（Vacuum Freeze-drying），简称“冻干”，是在适宜的真空度下将物质中的水分析出的技术，已广泛应用于生物制品、医药、食品、花卉产业、标本制作和古书籍保护等领域［22］。生物制品通过真空冷冻干燥制成冻干品后，具有稳定、易复溶等优势，便于保存和运输。商品化的人源D-dimer蛋白多以液体形式保存于血清中，对保存和运输条件要求苛刻。以健康新生牛血清作为冻干基质对D-dimer蛋白进行冻干，制备的D-dimer冻干品具有良好的稳定性和实用性。

近年来，D-dimer研究多集中于生理意义的剖析和医学价值的探讨，本研究着重介绍人源D-dimer的制备及其冻干性质的分析。通过逐步酶解和真空冷冻干燥获得稳定高效的D-dimer冻干品，旨在为人源蛋白的制备和保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

人源纤维蛋白原、人源凝血酶、人源纤溶酶、抑肽酶、Tris-base购自Sigma公司；人源Factor XIIIa购自AssayPro公司；0.22 μm滤器、Amicon Ultra-15（MWCO：100KDa）购自Millipore公司；健康新生牛血清、PageRuler Unstained High Range Protein Ladder购自Thermo Scientific公司；D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒（免疫层析法）为广州万孚生物技术股份有限公司（Wondfo）自主研发；其它试剂均为国产分析纯。

蛋白电泳仪、Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；医用冷藏箱购自中科美菱公司；AutoRep E 连续分配器购自RAININ公司；CHRIST ALPHA 1-2/ LD PLUS冻干机购自Martin Christ公司；-86℃立式医用低温保存箱购自SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 D-dimer的制备

1.2.1.1 纤维蛋白原的酶解 称取适量纤维蛋白原至离心管中，溶入TBS（20 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，2 mmol/L KCl，pH7.4）至终浓度为5 mg/mL，加入凝血酶（终浓度1 U/mL）、Factor XIIIa（终浓度5 μg/mL），37℃水浴4-6 h，即得到白色胶状交联纤维蛋白。

1.2.1.2 交联纤维蛋白的洗涤 取出交联纤维蛋白至50 mL离心管中，使用TBS颠倒洗涤数次，放于37℃恒温摇床中振荡洗涤约2-3 h。

1.2.1.3 交联纤维蛋白的酶解 取出洗涤完毕的交联纤维蛋白至干净的离心管，加入TBS（交联纤维蛋白湿重终浓度200 mg/mL）、纤溶酶（终浓度5 mU/mL），37℃水浴至溶液中不再有絮状交联纤维蛋白。向反应体系中加入抑肽酶（终浓度1 μg/mL），充分混匀。

1.2.1.4 D-dimer的超滤 使用0.22 μm无菌滤器将新制的D-dimer溶液过滤至超滤管（MWCO：100KDa）中，超滤浓缩（2 000×g，20 min，4℃）。向浓缩液中加入适量TBS，再次进行超滤浓缩（2 000×g，20 min，4℃），分装制得的D-dimer浓缩液，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 D-dimer冻干性质的分析

1.2.2.1 D-dimer的活性检测与冻干方案的筛选 使用D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒（免疫层析法，线性范围：0.1-10 mg/L）检测制备的D-dimer活性。为提高D-dimer稳定性，将其制成D-dimer冻干品。以3 mL棕色玻璃瓶为容器，每瓶加入500 μL D-dimer冻干工作液。通过调节真空冷冻干燥时的真空度及冻干时间、冻干稀释液组份及pH，对冻干方案进行筛选及优化。根据D-dimer冻干品的精密度和系列稳定性，选定最佳冻干方案。

1.2.2.2 D-dimer冻干品的稳定性分析 为验证D-dimer冻干品的稳定性，使用Wondfo D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒监测D-dimer冻干品在37℃稳定性、复溶后4℃/25℃稳定性、不同溶剂复溶冻干品对其活性检测的影响等。

2 结果

2.1 D-dimer的制备和超滤

将纤维蛋白原酶解体系置于37℃水浴中，白色交联纤维蛋白迅速生成，反应体系完全呈胶状。酶解体系中的交联纤维蛋白在37℃水浴中逐渐萎缩，直至完全消失。新制的D-dimer溶液活性远超出D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒的检测范围，需适度稀释后用于定量检测。经SDS-PAGE凝胶电泳和Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统分析，交联纤维蛋白的降解产物中，D-dimer纯度约为60%；超滤后，小分子蛋白被大量除去，D-dimer纯度升高至90%（图1）。使用A280nm紫外吸收法检测D-dimer溶液浓度，发现D-dimer蛋白总量约为纤维蛋白原的一半，即制备得率约为50%。

图1 D-dimer的SDS-PAGE凝胶电泳纯度分析

2.2 D-dimer的活性检测与冻干方案的筛选

经过多次摸索和验证，按照一定的比例将D-dimer蛋白溶液稀释成位于D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒检测范围内的3个不同的浓度（高浓度H、中浓度M、低浓度L）。鉴于临床检测的D-dimer样品多以全血或血浆为基质，本研究拟以健康新生牛血清作为D-dimer蛋白的冻干保护剂。冻干前，使用冻干稀释液（50 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，pH8.0）调节新生牛血清比例（冻干稀释液组份及pH经多次正交试验筛选和优化而得，详细步骤略）。根据冻干品的系列稳定性检测结果，将冻干保护剂定为12%新生牛血清，真空冷冻干燥真空度：0.025 mbar（Main Drying）/0.012 mbar（Final Drying），冻干时间由冻干样品的总装液量而定。冻干后，从每个浓度的冻干品中随机取出10支进行检测。稀释后的D-dimer冻干品活性值均位于检测试剂的检测范围内，3个浓度冻干品的批内精密度（C.V）均小于15%（表1）。

表1 Wondfo试剂检测D-dimer冻干品均值与精密度

2.3 D-dimer冻干性质的分析

随机选取D-dimer冻干品用于各项检测，参考区间由检测精密度时的均值而定，即：x-±25%。检测发现，D-dimer冻干品可在37℃稳定保存12 d（表2），复溶后在4℃稳定保存30 d（表3），复溶后在25℃稳定保存8 d（表4）。

表2 D-dimer冻干品37℃稳定性

检测不同溶剂复溶冻干品对其活性检测的影响时，选用去离子水、三蒸水、生理盐水、瓶装矿泉水（农夫山泉）和自来水复溶冻干品。经检测，选用的5种溶剂复溶冻干品时对其活性检测均无明显影响（表5）。

3 讨论

继Ruckley等［23］于1970年发现血清FDP对肺栓塞具有重要的诊断价值之后，Gaffney在FDP中分离得到将近200 kD大小的“γ-γ dimers”，将其命名为 D-dimer，并预言“D-dimer检测可能会成为有用的诊断依据”［24-26］。经过多年的研究和临床验证，研究人员发现D-dimer分子量约为180 kD，等电点（pI）为4.9-5.3，在健康人体内的半衰期约为8 h［27］，是交联纤维蛋白降解的特异性产物，对多项疾病的诊断具有重要的检测意义。由于D-dimer不存在疾病特异性，在临床诊断中，D-dimer以

其高度的敏感性和阴性预示能力时常用于筛查项目和辅助诊断。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布的《Global status report on noncommunicable diseases（2010）》报告称，心脑血管疾病已成为全球头号死因，每年死于心脑血管疾病的人数约占全球死亡人数的30%［28］。鉴于D-dimer可作为血栓形成性疾病诊断和溶栓药物疗效监测的特异性标志物，D-dimer检测对血栓导致的心脑血管疾病的及早诊断和治疗，便显得尤为重要。

目前，国内多采用进口D-dimer抗原进行相关研究或制备单克隆抗体。进口抗原纯度虽高，但价格昂贵，且多以液体形式保存，严重制约了D-dimer的研究及其运输和保存。本研究采用逐步酶解法和超滤即获得高纯度高活性的D-dimer蛋白，并通过真空冷冻干燥将其制成稳定的D-dimer冻干品。选用健康新生牛血清为冻干基质，冻干品复溶后几乎可作为天然D-dimer抗原使用。制备的D-dimer蛋白浓度约为5.6 mg/mL，使用Wondfo D-二聚体（D-dimer）定量检测试剂盒检测1 000倍稀释后的蛋白溶液冻干前的活性约为5.0 mg/L，冻干后的活性约为4.5-5.0 mg/L，检测时的活性收率和冻干时的活性收率均超过90%。

表3 D-dimer冻干品复溶后4℃稳定性

表4 D-dimer冻干品复溶后25℃稳定性

表5 不同溶剂复溶D-dimer冻干品对其活性检测的影响

笔者曾在D-dimer超滤浓缩前，使用HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR（GE）对其进行多次纯化，纯化效率均不理想。D-dimer经HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR纯化后，蛋白纯度未能明显提高，蛋白浓度却因被稀释而明显降低。鉴于超滤后的D-dimer纯度约为90%，可满足D-dimer常规研究使用，如用作室内质控品/物、阳性对照、免疫或初筛单克隆抗体。

Shackell［29］于1909年使用真空干燥技术将补体、抗毒素、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干，制成可以稳定保存的冻干品。随着冻干原理的深入研究和冻干设备的改良，真空冷冻干燥技术现已发展成为集多门学科于一体的综合技术工艺。在冻干过程中，预冻过的物料置于真空条件下进行升华干燥，除去冰晶（约占全部水分的90%），升华干燥完成后进入解析干燥，除去未冻结水，至物料中水分含量＜3%［30］。制成的D-dimer冻干品呈多孔饼状，对温度、浓度或蛋白酶都具备较高的耐受程度，且易复溶和恢复活性。为使制备的D-dimer冻干品更接近于D-dimer天然抗原，以符合临床检测标准，本研究使用新生牛血清作为冻干基质对D-dimer进行冻干。D-dimer冻干品在37℃稳定保存12 d；复溶后

在4℃稳定保存30 d；复溶后在25℃稳定保存8 d；使用常规溶剂复溶对活性检测无明显影响。

4 结论

本研究阐述了一项简捷高效的人源D-dimer制备方案，以人源纤维蛋白原为原材料，先后经过凝血酶、Factor XIIIa、纤溶酶等酶解和超滤即制得高纯度的人源D-dimer蛋白，适于临床研究的D-dimer冻干品具备较好的稳定性。

［1］Soheir SA, Nigel SK, Charles SG. D-dimer antigen：current concepts and future prospects［J］. Blood, 2009, 113（13）：2878-2887.

［2］Michael WM, Kevin RS, David AM. The structure and biological features of fibrinogen and fibrin［J］. Annals of the New York Academy of Sciences, 2001, 936（1）：11-30.

［3］Dempfle CE, Mosesson MW. Theme issue：fibrinogen and fibrin--structure, function, interactions and clinical applications［J］. Thrombosis and Haemostasis, 2003, 89（4）：599-600.

［4］Reganon E, Aznar J, Vila V. Degradation of human fibrinogen by plasmin：A kinetic study［J］. Thrombosis Research, 1977, 10（3）：411-419.

［5］Francis CW, Marder VJ, Martin SE. Plasmic degradation of crosslinked fibrin. I. Structural analysis of the particulate clot and identification of new macromolecular-soluble complexes［J］. Blood, 1980, 56（3）：456-464.

［6］Tsuneaki S, Motoaki S, Satoshi O. Evidence that D-dimer levels predict subsequent thromboembolic and cardiovascular events in patients with atrial fibrillation during ora anticoagulant therapy［J］. J Am Coll Cardiol, 2010, 55（20）：2225-2231.

［7］Renee AD, Melanie T, Roger EG, et al. Using an age-dependent D-dimer cut-off value increases the number of older patients in whom deep vein thrombosis can be safely excluded［J］. Haematol, 2012, 97（10）：1507-1513.

［8］Bastos RD, Bogutchi T, Rezende SM, et al. Duration of symptoms and D-dimer testing in the ruling-out of venous thromboembolism［J］. J Thrombosis and Haemostasis, 2006, 4（9）：2079-2080.

［9］Wells PS. Integrated strategies for the diagnosis of venous thromboembolism［J］. J Thrombosis and Haemostasis, 2007, 5（1）：41-50.

［10］Wells PS, Anderson DR, Rodger M, et al. Evaluation of D-dimer in the diagnosis of suspected deep-vein thrombosis［J］. N Engl J Med, 2003, 349（13）：1227-1235.

［11］Carr JM, McKinney M, McDonagh J. Diagnosis of disseminated intravascular coagulation. Role of D-dimer［J］. American Journal of Clinical Pathology, 1989, 91（3）：280-287.

［12］Lawler CM, Bovill EG, Collen DJ, et al. Fibrin fragment D-dimer and fibrinogen B beta peptides in plasma as markers of clot lysis during thrombolytic therapy in acute myocardial infarction［J］. Blood, 1990, 76（7）：1341-1348.

［13］Bayes-Genis A, Mateo J, Santalo M, et al. D-Dimer is an early diagnostic marker of coronary ischemia in patients with chest pain［J］. American Heart Journal, 2000, 140（3）：379-384.

［14］Dougu N, Takashima S, Sasahara E, et al. Differential diagnosis of cerebral infarction using an algorithm combining atrial fibrillation and D-dimer level［J］. European Journal of Neurology, 2008, 15（3）：295-300.

［15］Antoniou D, Pavlakou G, Stathopoulos GP, et al. Predictive value of D-dimer plasma levels in response and progressive disease in patients with lung cancer［J］. Lung Cancer, 2006, 53（2）：205-210.

［16］Mirshahi SS, Pujade-Lauraine E, Soria C, et al. D-dimer and CA 125 levels in patients with ovarian cancer during antineoplastic therapy prognostic significance for the success of anti-cancer treatment［J］. Cancer, 1992, 69（9）：2289-2292.

［17］Oya M, Akiyama Y, Yanagida T, et al. Plasma D-dimer level in patients with colorectal cancer：Its role as a tumor marker［J］. Surg Today, 1998, 28（4）：373-378.

［18］Sutherland DE, Weitz IC, Liebman HA. Thromboembolic complications of cancer：epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and treatmen［tJ］. American Journal of Hematology, 2003, 72（1）：43-52.

［19］Roberts LN, Patal RK, Arya R. Haemostasis and thrombosis in liver disease［J］. British Journal of Haematology, 2009, 148（4）：507-521.

［20］Ceriello A, Taboga C, Giacomello R, et al. Fibrinogen plasma levels as a marker of thrombin activation in diabetes［J］. Diabetes, 1994, 43（3）：430-432.

［21］Zhou HY, Chen R, Liu XP, et al. Determination of plasma D dimer in patients with pregnancy induced hypertension［J］. Chinese

Journal of Obstetrics and Gynecology, 1997, 32（6）：347-349.

［22］Przic DS, Ruzic NL, Petrovic SD. Lyophilization-the process and industrial use［J］. Hemijska Industrija, 2004, 58（12）：552-562.

［23］Ruckley CV, Das PC, Leitch AG, et al. Serum fibrin/fibrinogen degradation products associated with postoperative pulmonary embolus and venous thrombosis［J］. Br Med J, 1970, 4（5732）：395-398.

［24］Gaffney PJ, Brasher M. Subunit structure of the plasmin-induced degradation products of crosslinked fibrin［J］. Biochimica et Biophysica Acta, 1973, 295（1）：308-313.

［25］Gaffney PJ. Distinction between fibrinogen and fibrin degradation products in plasma［J］. Clinica Chimica Acta, 1975, 65（1）：109-115.

［26］Gaffney PJ. D-dimer. History of the discovery, characterization and utility of this and other fibrin fragments［J］. Fibrinolysis, 1993, 7（2）：2-8.

［27］Franks JJ, Kirsch RE, Kao B, et al. Fibrinogen and fibrinogenrelated peptides in cancer［J］. Pathophysiology of Plasma Protein Metabolism, 1984：265-278.

［28］Alwan A. Global status report on noncommunicable diseases 2010［R］. World Health Organization, 2011.

［29］Shackell LF. An improved method of desiccation, with some applications to biological problems［J］. American Journal of Physiology, 1909, 24（3）：325-340.

［30］Wang W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals［J］. International Journal of Pharmaceutics, 2000, 203（1）：1-60.

（责任编辑 马鑫）

Preparation and Analysis of Lyophilization Characterization of Human D-dimer

Wu Jianwei Cai Lei Wang Jihua Tang Shixing
（National Engineering Laboratory of Rapid Diagnostic Test， Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou 510663）

D-dimer is formed by sequential action of 3 enzymes from fibrinogen. After producing D-dimer, we did the research on its lyophilization process. To produce cross-linked fibrin, fibrinogen was digested by thrombin and Factor XIIa. Then, fibrin degradation products（FDP）was prepared from cross-linked fibrin being degraded by plasmin. D-dimer was purified from FDP through ultrafiltration and prepared into lyophilized powder. By optimizing the lyophilization program, lyophilized D-dimer was stable for at least 12 days at 37℃, stable for at least 8 days at 25℃ and 30 days at 4℃ after reconstitution, and not different when being dissolved by different solvent.The preparation system established in this research is feasible and efficient. Depend on its stability, lyophilized D-dimer could be provided as biological raw materials for further research.

Fibrin Fibrinogen D-dimer Thrombus Lyophilized power

2014-05-12

国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2011AA02A103），广东省战略新兴产业核心技术攻关项目（2012A080800007）

武建伟，男，硕士，研究方向：免疫诊断；E-mail：Jarviswu@hotmail.com

唐时幸，男，博士，研究方向：免疫诊断；E-mail：tang.shixing@wondfo.com.cn