自诱导系统在酶促合成2’-脱氧胞苷中的应用

王玺段胜林熊舒莉郑桂兰张贵友王洪钟

（1.清华大学生命科学学院，北京 100084；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

自诱导系统在酶促合成2’-脱氧胞苷中的应用

王玺1段胜林2熊舒莉1郑桂兰1张贵友1王洪钟1

（1.清华大学生命科学学院，北京 100084；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

旨在高效合成2’-脱氧胞苷（dCyd）。DCyd作为一类重要的药物中间体，能够用于合成吉西他滨（dFdC）、扎西他滨（ddC）等多种抗病毒或抗肿瘤的药物。采用ZYM-Fe-5052自诱导培养基对含有N-脱氧核糖转移酶II（NDT）的大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导，所得完整菌体直接用于催化合成dCyd。结果表明，自诱导系统不仅无需额外添加诱导剂，还能够达到较高的菌体密度，且与LB诱导系统所得菌体在合成dCyd方面具有同样高效的催化活性。2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为1∶3时，产物转化率可高达86.5%。合成dCyd的最适反应条件为：2’-脱氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的浓度比为1∶1.5，pH6.5的磷酸缓冲液，1 mg/mL的菌体量，终体系10 mL，30℃条件下反应1 h，产物转化率可达71.9%。此方法还可用于制备其他核苷类似物，具有广泛的适用性和应用前景。

生物催化 N-脱氧核糖转移酶 2’-脱氧胞苷 自诱导系统 核苷类似物

核苷类家族不仅包含多种天然核苷，还包括碱基或糖基被修饰过的核苷类似物［1］。核苷类似物的化学结构与天然核苷有着不同程度的相似性，在细胞代谢中，可与正常核苷形成竞争关系，具有干扰核酸的合成及抑制相关聚合酶结合的作用，进而阻断肿瘤细胞和病毒的复制［2］。大部分的核苷类似物可以在治疗癌症和病毒感染的疾病中发挥重要作用［3-5］。其中，2’-脱氧胞苷（2’-deoxycytidine，dCyd）就是一类重要的药物中间体，能够用于合成抗癌药物吉西他滨（dFdC）、抗HIV病毒药物扎西

他滨（ddC）及生化试剂脱氧胞苷-5’-单磷酸（5’-dCMP）［6］等。目前，制备核苷类似物的方法主要有化学合成法和生物转化法。传统的化学合成法存在步骤繁多，反应条件苛刻，产物纯度低、分离困难，收率不高等缺点［7，8］，故在工业生产中很少使用。生物转化法主要用到两种酶：核苷磷酸化酶和N-脱氧核糖转移酶，前者通过2步反应可逆地催化核苷（或脱氧核苷）生成核糖-1-磷酸和碱基，核糖-1-磷酸再与另一种碱基结合生成新的核苷，但此酶不能用于催化合成胞嘧啶核苷类化合物［9］；后者主要来源于大肠杆菌、莱氏乳细菌和瑞士乳杆菌［10］，可通过一步催化反应高效地合成核苷类似物，反应过程中无中间体的产生［9］，且底物适用范围更广。

N-脱氧核糖转移酶最先是由MacNutt在瑞士乳杆菌中发现的［11］。随后有研究者利用亲和层析的方法从瑞士乳杆菌中纯化得到含有两种不同活性的N-脱氧核糖转移酶［12］：I 型（PDT），只能催化两种嘌呤碱基之间的转换反应（Pur ↔ Pur）；II型（NDT），不仅可以催化两种嘌呤之间的转换，还能够催化嘧啶与嘧啶、嘌呤与嘧啶之间的相互转换（Pur ↔Pur，Pur ↔ Pyr，Pyr ↔ Pyr）［13，14］。N-脱氧核糖转移酶II（NDT）的底物识别范围较广，能够用于合成多种有重要药用价值的核苷类似物［15，16］，但其更倾向于催化以脱氧嘧啶核苷为底物的反应［17］。已有文献报道，NDT基因的开放阅读框由474个核苷酸组成，用于编码158个氨基酸［18］。本试验即利用分子生物学手段构建得到含有NDT的原核表达菌，以脱氧胸苷和胞嘧啶为底物，在重组菌体的催化下高效合成2’-脱氧胞苷。

IPTG是对于lac基因簇十分有效的诱导剂，人们对其的研究已经比较成熟［19］。但由于IPTG具有价格昂贵、细胞毒性大等缺点，在菌种的大规模培养中不太适用［20］，而乳糖相对廉价且可以代替IPTG诱导乳糖操纵子的表达［21］。本试验即利用含有乳糖的ZYM-Fe-5052自诱导培养基诱导培养构建得到的重组大肠杆菌BL21/pET28a-ntd（BN）细胞，收集得到的全菌体直接用于催化2’-脱氧胞苷的合成。此自诱导培养基是由Studier在标准5052培养基的基础上改良得到的［22］，其中0.5%的甘油、0.05%葡萄糖和100 μmol/L FeCl3有利于菌体的高密度培养［23］，而0.2%的乳糖可以诱导酶的过量表达。本试验对比传统LB诱导系统与自诱导培养途径获得的菌体的生物转化活性，并对全菌体催化合成2’-脱氧胞苷的反应条件进行优化，旨在为自诱导培养基的进一步应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 胞嘧啶、胸腺嘧啶、脱氧胸苷和脱氧胞苷均购自于上海得恩德医药科技有限公司，Ex Taq DNA聚合酶、Nde I和EcoR I限制性内切酶均购自于TaKaRa生物技术有限公司，DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自于北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 仪器 Waters 600 series高效液相色谱仪，PCR仪，SDS-PAGE蛋白电泳系统，DYⅢ20A型水平电泳槽，紫外分光光度计，恒温摇床，离心机等。

1.1.3 菌种和质粒 瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，pMD18-T质粒，克隆菌株大肠杆菌DH5α和表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）均购自于全式金生物技术公司，pET-28a（+）质粒购自于Novagen公司。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 MRS液体培养基 蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.5%，柠檬酸二铵0.2%，乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，碳酸钙2%。用氢氧化钠溶液调节pH值为6.8，121℃灭菌15 min。

1.1.4.2 LB液体培养基 酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，121℃灭菌15 min。

1.1.4.3 ZYM-Fe-5052自诱导培养基 蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，甘油0.5%，0.2%乳糖，0.05%葡萄糖，25 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NH4Cl，25 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，100 μmol/L FeCl3，121℃灭菌15 min。

配制相应的固体培养基时，加入1.5%左右的琼脂后灭菌。

将含有目的基因片段的瑞士乳杆菌在MRS培养基中复苏培养［24］。构建完成的原核表达菌株利用两种诱导系统进行诱导表达：LB培养基加IPTG诱导

剂和ZYM-Fe-5052自诱导培养系统。

1.2 方法

1.2.1 表达菌株的构建 将瑞士乳杆菌干粉于MRS液体培养基中复苏培养24 h后，传代进行2次培养，以此菌液为模板进行PCR来扩增目的片段。利用GenBank中查找得到的瑞士乳杆菌N-脱氧核糖转移酶II基因（ndt）的核酸序列（登录号：NC-010080），设计一对扩增引物：ndt（+）：5'-CGCCATATGATGAACAAGAAAAAGAC-3'和 ndt（-）5'-CGGGAATTCTTAATATACAGCTCCG-3'，下划线标注序列分别为Nde I和EcoR I限制性酶切位点。PCR反应体系中包含10×Ex Taq缓冲液II 5 μL，dNTP 5 μL，引物各0.5 μL，菌液模板1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，补加ddH2O至终体积50 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃保温10 min，4℃保存。

利用DNA胶回收试剂盒对PCR产物中的目的片段进行回收，与pMD18-T克隆载体在16℃条件下连接8 h后，转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过测序及序列比对筛选获得阳性克隆菌株。然后用Nde I和EcoR I限制性内切酶分别对pMD18-T-ndt和pET-28a质粒在37℃水浴锅中进行双酶切，所需酶切片段进行DNA回收后16℃条件下连接8 h，并转化导入表达菌株BL21（DE3）中，筛选得到重组大肠杆菌BL21-pET28a-ndt（BN）阳性表达菌株。

1.2.2 N-脱氧核糖转移酶II基因的表达及SDSPAGE检测 表达菌株BN在两种诱导系统中进行诱导培养，利用分光光度计分别测定两种诱导途径所产生的菌体密度的增长曲线。用于获得含酶菌体的两种诱导方法为：①将1 mL过夜复苏培养的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的传统LB培养基中，培养至OD600为1.0左右，加入0.1 mmol/L的IPTG，继续诱导培养4 h。②将1 mL过夜复苏的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的ZYM-Fe-5052自诱导培养基中，培养总时间与LB诱导系统相同。诱导结束后，6 000×g离心10 min收菌，用pH7.0的磷酸缓冲液冲洗一次，菌体保存于-20℃待用。

诱导前及诱导后分别取1 mL菌液，用于SDSPAGE检测。取样菌液在12 000 r/min离心2 min，弃上清，沉淀用30 μL的无菌水和10 μL 4×蛋白SDS-PAGE上样缓冲液重悬，并将重悬溶液于沸水中煮10 min，12 000 r/min离心2 min，取2.5 μL上清用于检测目的蛋白是否成功表达，并以含有空白pET-28a（+）质粒的BL21（DE3）表达菌株作为对照。所用SDS-PAGE分离胶浓度为15%。

1.2.3 N-脱氧核糖转移酶II的活性测定 以脱氧胸苷和胞嘧啶为底物，利用表达N-脱氧核糖转移酶II的完整菌体催化合成脱氧胞苷，通过高效液相色谱仪（HPLC）检测酶蛋白的催化活性，其反应式如图1所示。

图1 合成2’-脱氧胞苷的反应式

初定的标准反应体系（终体积10 mL）为：30 mmol/L 脱氧胞苷和45 mmol/L 胞嘧啶（底物比1∶1.5）溶于50 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，在5 mg/mL完整细胞的催化下，40℃恒温摇床中进行反应。反应结束后，将反应液于沸水中保温5 min以终止酶反应，冷却至室温，然后用超纯水稀释20倍，并用0.45 μm的滤器过滤上清液，用于HPLC的上样检测。

HPLC检测条件为：色谱柱选用Diamonsil C18柱，5 μm（φ250×4.6 mm），紫外检测波长为245 nm，流动相为15%的甲醇和85%的水，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温为25℃。

HPLC图谱中目的产物的峰面积和产物的产量成正比，本试验以此为基础制定了脱氧胞苷的标准曲线。利用标准曲线及反应结束后目的产物的峰面积，可以计算得到产物的转化率。转化率（T）的计算方法为：T=（实际脱氧胞苷的产物峰面积/理论

所得脱氧胞苷的产物峰面积）×100%。

1.2.4 酶催化条件的优化 依据N-脱氧核糖转移酶II的酶学性质［25］及考虑其他可能影响产物生成率的因素，在试验中分别测定了不同菌体量（1、2.5、5和10 mg）、不同反应温度（20℃、30℃、40℃、50℃和60℃）对dCyd转化率的影响。并且依据已有文献报道，N-脱氧核糖转移酶II（NDT）在pH接近7.0时催化活性最高［8］，故选择测定了酸碱度在中性左右的4组不同pH的磷酸缓冲液（5.8、6.5、7.0和7.8）对催化反应的影响。另外，在可逆反应中，不同的底物浓度比对目的产物的转化率也会存在不同程度的影响。本研究选用相对廉价的脱氧胸苷和胞嘧啶为底物来合成2’-脱氧胞苷，其中，胞嘧啶的价格低于脱氧胸苷。考虑经济因素，选择测定了5组不同的底物浓度比（2’-脱氧胸苷∶胞嘧啶为1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶3）对dCyd转化率的影响。

2 结果

2.1 N-脱氧核糖转移酶II基因的克隆及重组菌株

的构建

本试验以瑞士乳杆菌全菌体为模板通过PCR得到N-脱氧核糖转移酶II的基因片段，目的片段回收后的电泳条带（图2-A）显示，其大小在500 bp左右。NDT基因与pMD18-T质粒连接后，转化导入大肠杆菌DH5α中，得到阳性克隆菌株菌落鉴定结果（图2-B），经测序后与GenBank中查找到的序列对比，结果表明序列一致。提取质粒，经双酶切后，将目的片段与pET-28a（+）质粒相连接，导入表达菌BL21（DE3）中，获得序列一致的阳性表达菌BN，其菌落鉴定结果（图2-C）表明，已成功构建得到含有NDT的原核表达菌株。

图2 ndt的PCR扩增及菌落鉴定

2.2 N-脱氧核糖转移酶II基因的表达及SDS-PAGE检测

表达菌株BN在两种诱导体系中培养相同时间后，离心收集菌体。菌体总蛋白经SDS-PAGE分析（图3）表明，两种诱导途径均能成功诱导得到目的蛋白。由于重组N-脱氧核糖转移酶II的N端连接一段约2 kD的His标签，故重组酶蛋白的大小在20 kD左右，SDS-PAGE图中目的条带位置与预测的一致。

图3 重组NDT的SDS-PAGE检测

另外，在OD600的条件下，菌体密度测定的结果（图4）表明，加入0.1 mmol/L 的IPTG之后，菌体量的增长也会受到抑制。BN菌株在两种诱导培养基中诱导4 h后，自诱导培养基中的菌体密度明显高于LB诱导系统，在诱导结束后，NDT酶的总含量也有相应的提高（图3）。

图 4 两种诱导途径的菌体生长曲线

2.3 N-脱氧核糖转移酶II的活性测定

为计算产物的转化率，测定了2’-脱氧胞苷标准样的质量与HPLC图谱峰面积之间的关系，制定了标准曲线（图5）。为了测定酶是否具有催化活性，利用标准反应体系在30℃条件下反应15 min后，对反应样品进行HPLC检测，结果（图6）表明含有NDT的完整细胞能够成功催化2’-脱氧胞苷的合成。

图5 2’-脱氧胞苷（dCyd）的标准曲线

图6 表明NDT催化活性的具有代表性的HPLC图谱

此外，本试验还测定了不同量的菌体对产物生成率的影响，结果（图7-A）表明诱导后的重组细胞具有很高的催化活性，1 mg/mL的菌体量就足以快速催化产物的合成，而菌体用量越多，杂酶的含量也相应增多，从而引发更多的副反应，导致产物量随着反应时间的延长而下降。对比两种诱导途径得到的相同的菌体量对产物转化率的影响（图7-B和图7-C），并对各个时间点的两组平行数据进行方差分析和T检验，统计学分析的结果显示两组数据在0.05水平上不具备显著性差异，表明自诱导培养途径得到的完整菌体与传统培养基诱导得到的菌体具有同样高效的催化活性。

2.4 合成2-脱氧胞苷的催化条件的优化

2.4.1 反应温度对产物转化率的影响 试验测定了不同反应温度对催化合成2’-脱氧胞苷的影响，反应1 h后的结果（图8-A）表明，在30℃反应条件下，产物转化率较高且产物量相对比较稳定。

2.4.2 缓冲液pH对产物转化率的影响 不同酸碱度的缓冲液的影响（图8-B）表明，构建得到的全菌体在弱酸性条件下的催化活性较高，即pH为6.5的条件下能够获得较高的产物转化率。

2.4.3 底物浓度比对产物转化率的影响 测定两种底物浓度比的影响（图8-C）表明，两种底物间浓度比越大，产物的转化率越高，当脱氧胸苷∶胞嘧啶为1∶3时，2’-脱氧胞苷的转化率可高达86.5%。

3 讨论

本试验通过分子生物学手段构建得到含有NDT的重组菌株，用于高效一步反应催化合成2’-脱氧胞苷（dCyd）。构建菌株的诱导表达采用了两种不同的诱导培养系统：传统LB培养基加IPTG和ZYMFe-5052自诱导系统，其中自诱导培养基由于含有少量的甘油及FeCl3等成分，有利于获得更高的菌体密度及目的酶量［22］。同时，α-乳糖作为诱导剂，其价格和毒性均低于IPTG。

本研究是首次采用自诱导培养基对含有NDT的重组菌体进行诱导，并用诱导后的完整菌体催化合成dCyd。相关结果表明，试验构建的表达菌株能够高效催化底物转化为目的产物，但产物量会随反应时间的延长有所降低，原因可能是表达菌株内固有

的转氨酶催化目的产物发生了分解反应，且转氨酶在60℃条件下的活性较高，但在30℃条件下其活性可以被有效抑制［26］。降低表达菌株中固有酶对催化反应的影响，是很值得后续研究的方面，以便于在核苷类似物的工业化生产过程中获得稳定的产物量。

图7 不同菌量及两种诱导途径对产物转化率的影响

图8 不同反应条件对产物转化率的影响

试验测定了不同反应条件对产物转化率的影响，结果表明重组酶具有很高的催化活性，能够在短时间内达到较高产率。综合考虑经济因素和产物转化率，认为脱氧胸苷∶胞嘧啶为1∶1.5时为较适宜的底物浓度比。此浓度比与1∶1相比，底物中增加了15 mmol/L的胞嘧啶，但底物仍能够很好的溶解，而且胞嘧啶价格低于胸腺嘧啶，此浓度比与1.5∶1条

件下的产物生成率相当；而与1∶2相比，第2次增加15 mmol/L的胞嘧啶对产物转化率的提升相对较小；当浓度比为1∶3时，胞嘧啶不能较好地溶解，底物浪费程度高。依据结果，合成2’-脱氧胞苷适宜的反应条件为：30 mmol/L的脱氧胸苷和45 mmol/L的胞嘧啶，溶解于pH6.5的磷酸缓冲液中，加入1 mg/mL BN完整细胞在30℃条件下反应1 h，产物转化率可达71.9%。

到目前为止，自诱导培养基在酶蛋白的过量表达方面使用较少，所以本研究可以为自诱导培养基的广泛应用提供研究基础。此方法的优点在于无需在培养过程中额外添加诱导剂，简化了诱导培养的过程，减少了污染的可能性；乳糖作为诱导剂，其价格和毒性都低于IPTG；使用全菌体进行反应，省去了蛋白纯化的过程；自诱导培养系统还能够获得更高的菌体密度及目的蛋白量，且此方法获得的全菌体与传统诱导途径得到菌体的催化活性同样高效，故更适宜应用于核苷类似物的大规模生产过程。本试验还利用重组BN完整细胞成功催化5-杂氮-2’-脱氧胞苷的合成，表明此重组细胞及诱导方法适用于多种核苷类似物的合成，因此具有很大的应用价值及前景。

4 结论

本研究构建含有NDT酶的全菌体用于高效催化合成2’-脱氧胞苷。试验采用的自诱导方法操作简便，无需额外添加诱导剂；与传统LB诱导方法相比，在培养相同时间后，能够获得更高的菌体量及目的蛋白量，并且相同菌体量的催化能力相似，为自诱导培养基的进一步应用提供了研究基础。

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（责任编辑 马鑫）

Application of Auto-induction System in the Synthesis of 2’-deoxycytidine

Wang Xi1Duan Shenglin2Xiong Shuli1Zheng Guilan1Zhang Guiyou1Wang Hongzhong1
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

This experiment was carried out in order to synthesize 2’-deoxycytidine（dCyd）more efficiently. DCyd is a significant intermediate for many antiviral and anticancer drugs such as Gemcitabine（dFdC）, Dideoxycytidine（ddC）, etc. A convenient and efficient bioprocess was reported here to synthesize dCyd by E.coli BL21（DE3）containing gene of N-deoxyribosyltransferaseⅡ（NDT）overexpressed using ZYM-Fe-5052 auto-induction system. The results showed that auto-induction system could make the addition of inducer during cultivation unnecessary and obtain a higher cell density. The recombinant cells from auto-induction system were as efficient as that from LB system on the conversion yields of dCyd. When the ratio of 2’-deoxythymidine（dThd）and cytosine was 1∶3, the conversion yield could be 86.5%. The substrates ratio of 2’-deoxythymidine (dThd) and cytosine as 1∶1.5 and 1 mg/mL recombinant cells which were dissolved in phosphate buffer of pH6.5, then cultured at 30℃ for 1 h were selected as the suitable reaction conditions，and the conversion yield could be 71.9%. This method also has potential for the preparation of other nucleoside analogues.

Biocatalysis N-deoxyribosyltransferase 2’-deoxycytidine Auto-induction system Nucleoside analogues

2014-03-31

国家自然科学基金项目（21176138），国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金项目（J1103506，J1030622，J1310020）

王玺，女，硕士，研究方向：生物转化及生物催化；E-mail：wangxi1822@163.com

王洪钟，男，博士，副教授，研究方向：生物转化及生物催化；E-mail：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn