孵化基质pH对红耳龟和中华条颈龟孵化及血液生理指标的影响

李燕华+傅丽容+史海涛

摘要：为了探讨土壤酸化对红耳龟（Trachemys scripta elegans）和中华条颈龟（Mauremys sinensis）孵化及稚龟血液生理指标的影响，在孵化温度为（30±0.5） ℃，孵化基质pH分别为4、5、6、7的条件下，对比研究了两种龟卵孵化率、畸形率、孵化期和血液生理指标的变化。结果表明，两种龟卵孵化率均随孵化基质pH的降低而降低，pH为4时可使胚胎致死，pH为7、6、5处理同种龟不同处理间和同种处理不同种之间孵化率差异不显著（P>0.05）；pH降低红耳龟孵化期缩短，胚胎发育加速，胚胎发育正常，而中华条颈龟畸形率升高（P<0.05）；两种稚龟血细胞变化不同，红耳龟红细胞长、短径变长，长短径比增加，红细胞数、白细胞数显著增加（P<0.05），中华条颈龟各项血液生理指标差异不显著。对比研究各项指标可知，红耳龟通过减少畸形率、提高急性应激刺激阈值，增强了对酸胁迫的耐受性。

关键词：红耳龟（Trachemys scripta elegans）；中华条颈龟（Maurenmys sinensis）；酸碱度；孵化；血细胞

中图分类号：Q959.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0149-04

Effect of Hatching Matrix pH on Hatching and Blood Physiological Indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis

LI Yan-hua，Fu Li-rong，SHI Hai-tao

（College of Life Sciences， Hainan Normal University， Haikou 571158， China）

Abstract： In order to explore the effects of soil acidification on egg hatching and baby blood physiological indexes of Trachemys scripta elegans and Mauremys sinensis， the experiment incubation temperature was（30±0.5） ℃，and pH of incubation matrix was 4， 5， 6， 7. Under these conditions， hatching rate， deformity rate， incubation period and blood physiological changes of the turtle eggs of both species were compared. The results showed that hatching rates of both species decreased as pH of hatching matrix decreased， and embryos were dead when pH was 4. There were no significant differences among turtles in different treatments of the same species and the same treatments of different species in condition of pH 5， 6， 7（P>0.05）； When pH decreased， hatching period of Trachemys scripta shortened， their embryos， growth accelerated in normal order while， deformity rate of Mauremys sinensis increased（P<0.05）. Blood cells of the two baby turtles changed differently. Both length-diameter and short diameter of Trachemys scripta elegans red cell became longer， ratio of length-diameter and short diameter increased， and the quantity of red cell and white cell increased significantly（P<0.05）. The comparative study of these indicators showed that trachemys scripta elegans enhanced tolerance to acid stress through reducing deformity rate and improving threshold of acute stress stimulation.

Key words： Trachemys scripta elegans； Mauremys sinensis； pH； hatching； blood cell

收稿日期：2013-07-16

基金项目：国家自然科学基金国际地区重大合作项目（30910103916）；海南省自然科学基金项目（310040）

作者简介：李燕华（1983-），女，河北邯郸人，实验师，硕士，主要从事动物生理研究，（电话）18789086177（电子信箱）green.wudi@163.com；

通讯作者，傅丽容（1964-），女，教授，主要从事动物繁殖生理研究，（电子信箱）flr@hainnu.edu.cn；史海涛（1963-），男，教授，博士，

主要从事两栖爬行动物生态学与保护生物学研究，（电子信箱）haitao-shi@263.net。

酸雨现已成为严重威胁世界环境的十大问题之一[1]，国内外许多学者的大量研究结果表明，酸雨对地球和脆弱的生态系统（包括海洋生态系统）造成了严重的威胁[2，3]。血液作为衡量动物体对环境适应状况、健康以及营养状况重要指标，在环境胁迫下变化尤其明显[4]。研究表明pH的下降能使鱼类血液红细胞载氧能力随之减弱[5]；影响膜蛋白的功能，使红细胞脆性增大，更易破裂[5]；还会抑制鲤鱼鳃组织酶活力，使体重下降[6]。酸雨造成的土壤酸化对土壤动物的生存也造成严重的威胁[7，8]，Marco等[9]对蜥蜴（Pogonu vitticeps）的研究表明，土壤pH的改变可能影响到卵与周围环境的水分和气体交换，或者直接改变卵内部的pH，最终影响到胚胎发育。而胚胎发育是动物生活史中的重要时期，也是对生态因子最敏感的时期[10]。龟鳖类动物卵生且无护卵行为，体外自然孵化，环境因子对孵化具有更大的影响[10]。所以，酸雨所导致的土壤酸化对龟鳖类动物在胚胎发育期的毒害作用不可忽视。

红耳龟（Trachemys scripta elegans）列为世界最危险的100个外来入侵物种之一[11]，其适应力强、生长速度快、高繁殖、易存活，与本地土著龟——中华条颈龟（Maurenmys sinensis）具有相似的生态位[12]，在野外情况下可存在于相同生境中[13]。当面临日益严重的酸雨所导致的土壤酸化胁迫时，处于胚胎发育期的两种龟对环境胁迫的耐受性及适应能力如何，目前还未见相关报道。本试验模拟了土壤酸化对红耳龟和中华条颈龟的胚胎期造成胁迫，通过对比研究检测两种龟孵化和稚龟血液指标变化，探讨红耳龟和中华条颈龟对酸性环境的耐受性，从生理学角度分析红耳龟入侵的机制，对防止红耳龟的入侵具有一定的指导意义，为保护物种多样性奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用红耳龟与中华条颈龟卵各120枚，2011年4月9日购自海南省文昌顺利农渔科技公司，胚盘明显，发育正常。

1.2 试验设计

选用蛭石孵化基质，以0.1 mol/L HCl调制蛭石，设置3个试验浓度组，试验组pH分别为4、5、6，对照组pH为7。将红耳龟与中华条颈龟卵各随机分成4组，每组30枚，置于智能生化培养箱中孵化。1周后剔除未受精卵，孵化温度保持在（30.0±0.5） ℃，空气相对湿度为85%，每日用IQ150土壤原位pH计测定孵化基质pH并做相应的调节，以保证孵化盒内基质pH的恒定。

1.3 孵化指标和血液生理指标检测

记录每只龟卵的孵化时间，统计并计算不同pH处理龟卵的孵化率、畸形率和孵化期。稚龟孵出24 h后进行血液生理指标的检测，包括血细胞计数和常规血涂片制作。

1.4 数据分析

数据利用Excel 2003和SPSS 16.0进行处理，所有试验数据均以±SD表示。（1）Kruskal-Wallis多独立样本非参数检验和χ2-检验不同pH处理对胚胎孵化率、畸形率的影响和血细胞数量变化；（2）方差分析（ANOVA）结合LSD法，检验不同孵化基质pH对胚胎孵化期的影响和血细胞形态变化。

2 结果与分析

2.1 基质pH对两种龟卵孵化率、畸形率和孵化期的影响

由表1可知，pH 4组的两种龟卵孵化率均为0，pH 7、pH 6、pH 5组随着pH的降低，两种龟卵孵化率均呈下降趋势，经Kruskal-Wallis多独立样本非参数检验差异不显著（χ2=2.01，df=1，P>0.05；χ2=0.13，df=1，P>0.05）。相同pH下，红耳龟孵化率低于中华条颈龟，差异不显著（P>0.05），说明孵化基质pH在一定范围内对稚龟胚胎发育有一定影响，过低的pH可使胚胎致死。

不同的pH处理，红耳龟发育正常，中华条颈龟出现畸形龟，畸形率随pH降低呈升高趋势。pH 5组，中华条颈龟畸形率极显著高于红耳龟（P<0.01）。红耳龟与中华条颈龟均表现出随pH降低，孵化期缩短。红耳龟孵化期pH 5组显著短于pH 7、pH 6组（P<0.05），中华条颈龟各组间差异不显著（P>0.05），说明低pH可缩短孵化期，影响红耳龟胚胎的发育速度。

2.2 基质pH对孵化稚龟血细胞形态的影响

测定两种稚龟红细胞长短径比，比较不同孵化基质pH处理下红细胞形态的变化（表2）。单因素方差分析表明，不同pH处理红耳龟稚龟红细胞形态差异显著（P<0.05）。红耳龟稚龟pH 5组红细胞长短径比为1.72±0.19，显著高于pH 6组1.64±0.17和pH 7组1.59±0.14，并表现出随pH降低，长短径比逐渐增大的规律。中华条颈龟稚龟红细胞长短径比差异不显著（P>0.05），形态差异不明显（P>0.05）。

2.3 基质pH对孵化稚龟血细胞数量的影响

孵化基质pH显著影响红耳龟稚龟红细胞、白细胞数量见表3。pH 7、pH 6、pH 5组红细胞数分别为（5.65±0.69）×1011、（6.36±0.99）×1011、（6.86±1.33）×1011个/L，随pH降低，红细胞数增多，且红细胞形态变化一致；白细胞数量随pH降低而增多，分别为（7.48±1.19）×109、（7.56±0.88）×109、（8.23±1.11）×109个/L。中华条颈龟稚龟的红细胞、白细胞数量变化不明显（P>0.05）。

两种稚龟血涂片观察均可见嗜中性、嗜酸性、嗜碱性、单核和淋巴5类白细胞。不同pH处理白细胞数量的不同主要表现在不同种类的白细胞所占的比例不同。低pH处理使红耳龟嗜中性粒细胞和淋巴细胞变化明显，pH 5组嗜中性粒细胞高于pH 7、pH 6组（P<0.05）；淋巴细胞低于pH 7、pH 6组（P<0.05）。中华条颈龟白细胞总数及各类白细胞所占比例差异不显著（P>0.05）。

3 小结与讨论

3.1 孵化基质pH对胚胎发育孵化率、畸形率和孵化期的影响

孵化环境影响孵化成功率、孵化期和幼体的大小、行为、生长等[14]，pH是影响胚胎发育重要生态因子之一[15]。研究表明，随着孵化环境pH的降低通常会影响水生动物的胚胎发育甚至导致畸形和死亡率的增加[15-17]。本试验中随孵化基质pH降低，两种龟死亡率均呈上升趋势，pH 4孵化基质可使胚胎致死。这与Peterson等[18]对大西洋鲑（Salmo salar）、Allan等[19]对斑节对虾（Penaeus monodon）的研究结果一致。这可能是因为过低pH条件下酶的活性受抑制，影响新陈代谢水平，从而影响胚胎发育，并且过低的pH使卵膜软化，失去弹性，胎易破膜死亡[20]，而微酸、中性环境对稚龟孵化率影响较小[21]。

酸胁迫环境下中华条颈龟稚龟出现畸形，畸形率显著高于红耳龟，可能与它们的卵壳结构不同有关。中华条颈龟为硬壳卵，通透性强，随高浓度氢离子浓度的增加，影响胚胎的渗透压平衡，使新陈代谢水平失调，造成卵膜某一结构破坏或功能丧失[15]。畸形个体在野外生存过程中自然比正常个体的适应性要差，红耳龟在这一方面是占据优势的。孵化期方面，红耳龟孵化期缩短使其比处在同一生态位的中华条颈龟更早抢夺食物、栖息地等资源。在自然界，孵化期越长，受到敌害和恶劣气候破坏的机会越多，缩短孵化期对动物具有重要意义。因而从畸形率、孵化期来说，酸胁迫对中华条颈龟的不利影响大于红耳龟。

3.2 孵化基质pH对两种龟血细胞形态的影响

血细胞是动物机体对自身生理状态变化和对外界环境因子刺激非常敏感的细胞，在载氧、机体免疫和凝血中起着重要的作用[22]。有研究表明，随pH的减小，红细胞吸水膨胀，使其形态指标值逐渐增大[23]。这与pH 7、pH 6、pH 5组红耳龟红细胞长、短径及二者比逐渐增大的结果一致。随着pH降低，红耳龟红细胞数量增多，中华条颈龟变化不明显，可能是与酸胁迫环境有关。长期以来一直认为酸性水体可使鱼类血液中的pH下降，使一部分血红蛋白与氧的结合受阻，从而减弱其载氧能力[24]。所以，pH的降低有可能会使稚龟胚胎缺氧，使贮藏性红细胞释放[25]，红细胞增多是一种获得缺氧代偿能力的表现[26]。另外，红细胞尚具有一定的非特异性免疫能力[27]。红耳龟血红细胞的增多是对恶劣环境的一种应激反应。

研究表明，机体可对外界或内部的各种异常刺激产生非特异性应答反应，在酸性环境下孵化可使两种胚胎受到刺激，发生急性或慢性应激反应[28]。受到急性刺激后，通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴产生糖皮质激素[29]。其中皮质酮可通过影响血浆中白细胞和抗体的数量而对免疫能力产生影响。当急性刺激转变成慢性刺激时，HPA的负反馈调节则会钝化甚至失效，慢性应激发生。由此引发的一系列副反应将对机体产生毒害作用[30]，已有大量试验证明，长期高水平的皮质酮可抑制鸟类的繁殖和免疫能力。红耳龟中嗜中性粒细胞增加体现了正常的免疫防御机制。中华条颈龟的白细胞数量随pH降低而增多，但差异不显著，正是免疫抑制的体现。由于中华条颈龟经历了由急性应激到慢性应激的转变，说明了其急性刺激阈值低于红耳龟，更易受到酸胁迫环境的不利影响。

由此可见，当胚胎发育过程中面对酸胁迫时，红耳龟较低的畸形率和缩短的孵化期特征都是有利于自身生存的，优于中华条颈龟，并以具有较高急性刺激阈值的特点，比中华条颈龟较少受到酸胁迫的不利影响，表现为较强的耐受性。

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