岷山红三叶根际优良促生菌对其宿主生长和品质的影响

荣良燕，姚拓，马文彬，李德明，李儒仁，张洁，陆飒

（1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学草业生态系统教育部重点试验室，甘肃 兰州730070；3.甘肃省草原技术推广总站，甘肃 兰州730046；4.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州730070）

长期以来，为了满足农作物生长所需的氮、磷等营养元素，工业化肥一直被认为是实现这一目标的主要途径。然而，随着化肥使用量不断增大，其负面影响日益明显，如导致土壤结构破坏、肥力下降，造成土壤微生物区系多样性破坏等诸多问题，并且由于生产化肥引起的水质、空气污染，非再生能源的大量消耗，食品安全等问题已成为困扰农业生产的主要因素［1］。近年来，随着人们生态保护意识的增强以及对无公害农作物生产的日益重视，探寻新的肥料来源（尤其是生物肥料）以替代工业化肥的研究倍受关注。

岷山红三叶（Trifoliumpratensecv.Minshan）属高产型优质牧草，营养全面，再生性强，并且含有大量的异黄酮多酚化合物。研究资料表明，异黄酮具有较强的清除自由基能力，岷山红三叶中可提取的异黄酮含量（1.0%～2.6%）远高于大豆异黄酮（0.1%～0.3%）［2］。为了满足红三叶生存、生产所需的氮、磷等营养元素，大量化学肥料被用于红三叶以获得较高产量。然而，在经济落后、土壤贫瘠的地区，大量使用化肥不但增加了农业生产成本，而且造成了环境及食品污染，同时随着化肥施用量的增加，出现了肥效降低、利用率下降等现象。因此，探寻新的生物生态肥源，以实现对工业化肥的部分替代或完全替代的目标已迫在眉睫。

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是存在于植物根际或根表，可以促进植物生长或拮抗病原菌的微生物。PGPR不仅可以分泌植物促生物质（如植物激素、维生素、氨基酸、其他活性有机小分子衍生物等），还可以改善植物根际的营养环境（如PGPR在植物根际的代谢作用加强了土壤中有机物的分解，促进了植物营养元素的矿化，增加了作物的营养供应）。此外，PGPR还具有控制植物病害，降解土壤污染物的作用［3－4］。利用不同环境、不同植物群落根际分离、筛选的优良促生菌研制的生物菌肥不仅具有以上优点，还可以减少生产和使用农药、化肥带来的环境和食品污染及非再生能源消耗。因此，土壤微生物资源的定向利用已成为现代农业科技领域的研究热点之一。

目前，国内外学者已经研究出了可用于水稻（Oryzasativa）［5］、小麦（Triticumaestivum）［6］、玉米（Zea mays）［7］、番茄（Lycopersiconesculentum）［8］、樱桃（Prunusavium）［9］等作物的微生物肥料，并且取得了良好的效果，但关于PGPR微生物肥料应用于岷山红三叶的研究报道很少。随着西部生态环境建设和农业产业结构调整的不断推进，岷山红三叶的种植面积逐年扩大，其产业化功能在优质高效农业发展中发挥着重要作用。因此，选择和评价适宜的岷山红三叶微生物菌肥并将其推广使用具有重要意义。本研究从适宜岷山红三叶生长的环境中分离筛选根际优良促生菌，以制备有利于促生、防病综合功能的环保型复合根际菌肥，并研究用其部分替代化肥后对岷山红三叶生长及营养品质的影响，为微生物肥源部分替代化肥以减少购买性投入量，实现微生物资源定向利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

采样地位于甘肃岷县岷山红三叶种植基地，选择生长旺盛的岷山红三叶植株，附带根及周围土壤，装入无菌封口袋中，4℃保存。

1.2 岷山红三叶根际促生菌的筛选

1.2.1 初筛 将采集到的植株抖掉附着在根上的土壤，用无菌刷子收集根表层土壤，称取10g加入90mL无菌蒸馏水中，28℃下摇床震荡30min［10］。采用稀释法将菌悬液逐步稀释后涂布于PKO（Pikovaskaia’s）平板培养基上［10］，3～4个重复，28℃培养10d。观察平板上菌落生长及菌落周围透明圈情况，计算透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值并记录，D/d比值越大，溶磷能力越强。挑取菌落生长饱满，透明圈明显的单菌落保存。

1.2.2 复选 对初筛得到的菌株进行继代培养，1个月后将各菌株点接种至PKO平板上，计算D/d值，筛选出稳定产生透明圈的菌株，挑取整个单菌落接种在PKO液体培养基中，28℃，160r/min摇床培养13d。4℃，10000r/min离心15min，取上清液，以未接菌的培养液为对照，测定发酵液的pH值，并采用钼锑抗比色法测定菌液中有效磷增量，筛选出溶磷量较高的菌株，4℃斜面保存［11］。

1.3 促生菌株促生性能测定

对筛选出的菌株进行固氮酶活性、分泌吲哚－3－乙酸（indole－3－acctic acid，IAA）能力、拮抗病原菌能力的测定。固氮酶活性采用乙炔还原法（acelylene reduction assay，ARA）测定［7］，分泌IAA能力采用Salkowski比色法测定［11］，拮抗病原菌能力采用平板对峙法测定［12］。

1.4 岷山红三叶根瘤菌的分离与纯化

选取生长饱满、直径较大的根瘤，无菌水浸泡并冲洗3～5次，95%的乙醇浸泡30s，0.1%HgCl消毒5min，无菌水冲洗数次。用灭菌镊子夹破根瘤划线涂布在YMA（酵母甘露醇琼脂）平板培养基上，28℃培养，待菌落长出后挑取典型菌落划线培养，出现单菌落后4℃冰箱保存。

1.5 岷山红三叶复合菌肥的制作

1.5.1 菌株悬浮液及菌肥的制作 分别接种各优良PGPR菌株于50mL LB（Luria－Bertani，溶菌肉汤）液体培养基中，28℃，125r/min培养48h。待菌株充分生长后，用无菌水调节各菌株菌悬液浓度为1×108cfu/mL（波长660nm，OD值≥0.5）。300mL三角瓶内装入100mL LB液体培养基，灭菌后置于室温下1～2d，经检查无污染后分别接种20mL上述各菌悬液，于28℃，125r/min培养2～3d，将菌液注入灭菌玻璃瓶中常温密封保存备用。根瘤菌接种于YMA液体培养基中，其他方法同PGPR菌肥制作方法。

1.5.2 根际复合菌肥的制作 根际复合菌肥的制作参考韩华雯等［13］的方法。取PGPR菌和根瘤菌发酵液于室温下1～2h，无菌环境下，将两者按一定比例混合即可（菌株种类和比例正在申报专利）。

1.5.3 复合微生物菌肥的质检 采用平板计数法和显微观察计数法，具体方法参考《农用微生物菌剂》质量标准［14］。在储藏15，30，60，90，120，150，180，210，240，270d各检查一次，同时观察菌肥是否有霉变、异味等产生，若有效活菌数达1×108cfu/mL以上且无污染方可认为菌肥质量达标。

1.6 盆栽试验设计及方法

1.6.1 试验材料 试验种子：岷山红三叶由甘肃省草原技术推广总站提供，纯净度≥94%，发芽率≥88%。化学肥料：尿素（含N 46%），磷二铵（含P 46%，N 18%）。生物菌肥：岷山红三叶根际复合促生菌肥（即1.5中制作出的复合菌肥）。

花盆直径0.22m，深0.17m。盆栽土壤：土与营养土比例为2∶1，加入珍珠盐（混合土∶珍珠岩，20∶1）和少量垤石。土壤养分pH 7.05，有机质含量25.8%，有效氮75.05mg/kg，有效磷12.91mg/kg，有效钾180.29 mg/kg。

称取混合土壤2.5kg，添加0.4g尿素，0.9g磷二铵，混匀后装盆。选取饱满种子50粒于2012年9月底播种，播种深度1～2mm。2013年5月中旬、8月底分两次采集盆栽植株样品并分别测定产量、品质及异黄酮含量等。

1.6.2 促生菌肥使用方法及使用量 播种前种子用菌肥拌种，置阴凉处2h，待菌肥附着在种子表面后即可播种。

1.6.3 试验设计 试验设4个处理、1个对照。CK：全量化肥；A：菌肥；B：25%化肥＋菌肥；C：50%化肥＋菌肥；D：75%化肥＋菌肥。每个处理重复3次。

1.6.4 测定指标 干草产量，收获各处理的盆栽植株，常温下完全风干至恒重，称量后计算平均值。

营养品质测定，将岷山红三叶青干草用锤式粉碎机粉碎，粉碎机筛孔直径为0.6mm。粗蛋白（CP）采用凯氏定氮法测定。粗灰分（CA）采用马弗炉（550℃）直接灰化法测定。中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）分别采用Van Soest法和Roberston法测定。全磷量采用钼锑抗比色法测定。钙以EDTA络合滴定法测定［15］。

异黄酮含量测定方法：采用高效液相色谱分析仪进行测试［16］。色谱条件：Lichrospher C18色谱柱（2.6mm×250mm），柱温：30℃；检测波长：260nm；流动相：甲醇－水－1%乙酸0～50min，15%甲醇（含1%乙酸）－80%甲醇（含1%乙酸）梯度洗脱，流速：0.3mL/min，进样量：5μL。

1.7 数据处理

采用Excel 2010处理数据，使用SPSS 19.0进行统计分析，使用Origin 8.6绘图。

2 结果与分析

2.1 根际优良促生菌、根瘤菌及其促生特性

从岷山红三叶根际分离出129株根际促生菌，经过测定菌株的生长速度、溶磷量、分泌植物生长激素量和对病原菌的拮抗作用，筛选出了6株根际优良促生菌，同时从岷山红三叶根部分离出1株根瘤菌（表1）。6株促生菌生长速度均较快，菌株MHS7、MHS27兼具溶磷、分泌生长激素及抑制病原菌（Fusariumoxysporiumf.sp.cucumerinum、Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum）的能力；菌株MHS19具有良好的分泌植物生长激素的能力，菌株MHS30的溶磷量达到229.50 mg/L；1株根瘤菌属于慢生型根瘤菌，其固氮酶活性达到488.20nmoL/（mL·h）。

表1 岷山红三叶根际优良促生菌、根瘤菌及其促生特性Table 1 Characteristics of growth promoting rhizobacteria and rhizobium from clover

2.2 菌肥质量检查

有效活菌数及菌剂是否被杂菌污染是表征菌肥质量的重要指标。表2显示，制作的微生物菌肥在室温条件下，0～30d时有效活菌数呈上升趋势，30d时最高，为20.30×108cfu/mL，之后逐渐下降，在240d时有效活菌数均在108cfu/mL以上，并且无污染，270d时，菌肥中的有效活菌数下降至0.35×108cfu/mL，且伴有杂菌污染和霉变现象。因此，为了保证菌肥的质量，该菌肥制作后应当在8个月内使用。该菌肥符合《微生物肥料》NY227－94标准［17］。

表2 复合微生物菌肥质量检查Table 2 Quality check of compound microbial bacterial fertilizer

2.3 微生物菌肥对岷山红三叶干草产量的影响

干草产量是衡量牧草生产能力的重要指标。从表3可以看出，不同施肥处理对岷山红三叶第1茬干草产量影响差异显著（P＜0.05）。处理D干草产量显著（P＜0.05）高于CK（9.23%），说明75%化肥＋菌肥处理对岷山红三叶具有显著增产效果；处理C与CK相比无显著差异，说明该处理可以在不减产的同时，减少50%化肥的用量，从而有效降低生产成本；处理A、B与CK相比差异显著（P＜0.05），产量显著低于CK（第1茬）。各菌肥处理对岷山红三叶干草产量的增产效果主要体现在第1茬，处理C、D与CK相比，第2茬干草产量没有显著差异，但处理C、D略高于CK，这可能是由于菌肥在植株生长后期促生效果相对减弱造成。红三叶总干草产量也因不同菌肥处理而呈现出不同规律，其中处理D（75%化肥＋菌肥）效果最好，较CK高4.77%。

表3 不同施肥处理对岷山红三叶干草产量的影响Table 3 Effect of different fertilizer application on dry yield of clover g/盆Pot

2.4 微生物菌肥对岷山红三叶营养品质的影响

2.4.1 微生物菌肥对岷山红三叶粗蛋白、粗灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的影响 不同菌肥处理后岷山红三叶粗蛋白含量差异显著（P＜0.05）（表4）。处理D（75%化肥＋菌肥）效果明显优于CK，第1、2茬粗蛋白含量分别比CK高11.25%和11.56%。处理C（50%化肥＋菌肥）与CK相比无显著性差异，处理A和B使用效果均不及CK。各处理对两茬岷山红三叶中蛋白质含量变化影响较大，这可能与播种前为岷山红三叶种子接种根瘤菌有关，其固氮效果明显增加。

PGPR菌肥对两茬岷山红三叶粗灰分含量均有明显影响（表4）。两茬红三叶中粗灰分含量在各处理间差异显著（P＜0.05），岷山红三叶中粗灰分含量由高到低依次为：处理D＞处理C（对照CK）＞处理B＞处理A。

各施肥处理对两茬岷山红三叶中性洗涤纤维含量影响显著（P＜0.05）（表4），第1茬中处理D与CK之间差异显著（P＜0.05），处理D较CK中性洗涤纤维含量显著下降7.55%，处理C与CK之间差异不显著，处理A的NDF含量最高。第2茬处理CK、处理C与处理D之间差异均不显著，处理D的NDF含量最低。

两茬岷山红三叶酸性洗涤纤维含量因处理不同而存在明显差异（表4）。各处理中，除两茬处理D和第1茬处理C的ADF含量较CK有所降低之外，其余各处理ADF含量均高于CK，其中第1茬中处理C、处理D较CK分别降低4.50%和7.54%。第2茬处理C、处理D与CK之间差异不显著，处理A的ADF含量最高。

表4 不同施肥处理下岷山红三叶粗蛋白（CP）、粗灰分（CA）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量比较Table 4 Effect of different fertilizer application on crude protein（CP），crude ash（CA），neutral detergent fiber（NDF）and acid detergent fiber（ADF）content of clover %

2.4.2 微生物菌肥对岷山红三叶钙、磷含量的影响 岷山红三叶钙含量因菌肥不同而差异显著（P＜0.05）。除处理A外，其余处理红三叶含量均是第1茬高于第2茬，菌肥处理替代75%（处理B）化肥较CK钙含量显著下降15.38%（第1茬）、28.16%（第2茬）。第1茬，处理C（50%化肥＋菌肥）与CK差异不显著，处理D（75%化肥＋菌肥）显著高于CK 13.33%（P＜0.05）。第2茬，处理C、D与CK钙含量差异不显著（图1）。

复合菌肥不同处理对岷山红三叶磷含量影响明显，单施菌肥（处理A），岷山红三叶磷含量在第1茬较CK显著下降18.52%（P＜0.05），第2茬下降24.79%；菌肥替代75%化肥（处理B），两茬植株磷含量均有所下降，但下降幅度不明显。并且，第1茬的下降幅度低于第2茬。菌肥代替50%化肥（处理C），岷山红三叶磷含量较CK显著增加12.35%（第1茬）（P＜0.05），8.26%（第2茬），而处理D与C虽有差异，但不显著（图2）。

2.5 微生物菌肥对岷山红三叶异黄酮含量的影响

从表5可以看出，与CK相比，处理C、D对岷山红三叶中大豆黄素的含量无显著影响；处理A、B（第1茬）和处理A（第2茬）使大豆黄素的含量较CK下降37.5%，12.5%，42.1%。岷山红三叶中染料木黄酮的含量在两茬之间的变化规律与大豆黄素大致相同，处理C、D与CK相比并无显著性差异。此外，处理D显著提高了两茬红三叶中刺芒柄花素的含量（P＜0.05）。作为4种异黄酮中含量最高的鹰嘴豆芽素，处理C、D与CK间无显著性差异，处理A、B显著降低，说明减少一半以上化肥用量会对植株的异黄铜含量产生较大影响，其含量明显降低，而处理C可以在不降低异黄酮含量的情况下节省50%化肥的消耗。

图1 不同施肥处理下岷山红三叶钙含量的比较Fig.1 Comparison to calcium content of clover under different fertilizer application

图2 不同施肥处理下岷山红三叶磷含量的比较Fig.2 Comparison to phosphorus content of clover under different fertilizer application

表5 不同施肥处理下红三叶异黄酮含量比较Table 5 Effect of different fertilizer application on isoflavone content of clover %

3 讨论

3.1 根际优良促生菌（PGPR）对岷山红三叶生长的影响

土壤中氮、磷缺乏，有效利用率低是制约农作物增产增收的主要因素，微生物菌肥的研究利用为解决这一问题提供了有效途径。接种具有较高固氮酶活性的根瘤菌可以通过其生物固氮途径为作物提供环保的氮肥［18］，接种优良溶磷菌可以转化土壤中难以吸收利用的磷进而被植物吸收利用［19］。研究发现，将具有固氮、溶磷特性的PGPR菌肥应用于苹果树（Malusdomestica）［20］、草莓（Fragaria×ananassa）［21］、青稞（Hordeumvulgare）［22］、甘蔗（Saccharum）［23］取得了良好的效果。本研究也发现，将岷山红三叶根际分离出的根际促生菌（MHS30溶磷量229.50mg/L）与根部分离的根瘤菌MHSG1（固氮酶活性488.20C2H4nmol/mL·h）结合使用可以使岷山红三叶增产。此外，许多PGPR可通过自身代谢产生吲哚乙酸、脱落酸、细胞分裂素、赤霉素等植物激素，进而促进植物生长发育，调节植物的生命活动［8，24－25］。从表1可以看出，从岷山红三叶根际分离的MHS19根际细菌分泌IAA能力较强（12.01μg/mL），IAA对岷山红三叶根长以及根毛增生有良好的促进作用，这可能是岷山红三叶在减量施用化肥之后还可以保持较高产量的重要原因之一。类似结论出现在其他研究中，Shahab等［26］发现，PGPR培养液中可以检测到吲哚乙酸和吲哚丁酸，这两类物质有助于促进绿豆根径的生长。Wahyudi等［27］从印度尼西亚大豆（Glycinemax）根际分离得到的118株芽孢杆菌中，有76.3%具有促生能力，并且都会分泌吲哚乙酸。由此可见，PGPR产生的植物生长激素在植物促生过程中发挥着重要作用。PGPR的促生作用除了固氮、溶磷、分泌IAA外，还可以通过脂多糖、铁载体和水杨酸等介导使植物对疾病和病原菌产生系统抗性，进而对细菌、真菌和病毒产生拮抗作用，以达到防治病害的目的［28］。从岷山红三叶根际分离的菌株MHS27具有拮抗病原菌Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporumf.niveum的能力，将不同种类的PGPR菌株混合可能有助于产生更强的诱导系统抗性，从而提高岷山红三叶的抗病能力［29］，因此，岷山红三叶的增产效果离不开PGPR诱导系统抗性作用的发挥。这一促生机制已经在番茄和辣椒（Capsicumannuum）的研究当中得到了证实［30］。除以上作用机制外，PGPR还可以通过以下途径发挥促生作用，如：接种关键酶（如：ACC脱氨酶，几丁质酶等），或产生胞外多糖、根瘤菌毒素等［31］。其中，根瘤菌毒素在ACC脱氨酶作用的上游切断ACC合成路径，通过减弱高乙烯浓度对作物的胁迫并提高作物结瘤进而促进作物根系生长。另外，PGPR自身产生ACC脱氨酶，裂解乙烯前体物质ACC，降低植物体内的乙烯浓度，抑制乙烯对植物的三重反应，提高养分吸收和阳光的捕获面积，增加植物干物质积累，扩增根部组织，增强植物对根际微生物分泌或分解的促生物质和土壤养分的有效利用，进而促进生长［32］。

3.2 根际优良促生菌（PGPR）对岷山红三叶品质的影响

研究资料表明，微生物复合菌肥可以有效促进作物生长使其增产，降低生产成本，而且在改善作物营养品质方面也具有较大潜力。通过研究PGPR复合菌肥对岷山红三叶的施用效果发现，75%化肥＋菌肥的处理使红三叶中粗蛋白、粗灰分、钙、磷及异黄酮的含量较CK都有所增加。出现这样的结果与复合菌肥的溶磷作用及产生IAA有关，也可能是因为菌肥中的微生物协同作用的结果。菌肥中的有益微生物可分解释放土壤中被固定的养分供作物吸收利用，如解磷微生物分泌出的有机酸可以降低土壤pH，提高P、Ca、Fe、Mn等矿物元素的有效利用率［33－35］。此外，植物体内主要矿质元素（P、Ca、Fe、Mn、Zn）的吸收利用与乙烯浓度有很大关联，作物体内大量乙烯的产生会减少豆科作物根瘤的产生，影响其固氮效果，同时乙烯会抑制非豆科植物根的伸长，阻碍植物对土壤中的矿质元素的吸收和积累。Nadeem等［36］研究发现，降低乙烯浓度的关键是减少乙烯合成的前体ACC（1－氨基环丙烷－1－羧酸）的含量，PGPR产生的ACC脱氨酶将ACC脱氨基转化为α－酮丁酸，降低植物体内乙烯的合成，从而促进作物生长。这一研究成果在后续研究中得到了验证，研究发现在棉花（Gossypiumhirsutum）上接种包含ACC脱氨酶的菌株（Klebsiellaoxytoca）有助于提高主要营养元素（如：N、P、K、Ca）的吸收利用率，促使作物矿物元素的积累增加，促进作物根伸长、干重增加［37］。与单一接种剂相比，复合接种剂的使用对于提高作物营养品质具有明显优势。类似的结论在PGPR复合菌肥应用于三叶草（Trifoliumrepens）［38］、山莓（Rubuscorchorifoliusf.）［39］的研究当中也得到了证实。此外，适宜比例的化学肥料与微生物菌肥相结合的施用方式有助于提高土壤微生物种群密度，可以改善土壤微生态环境，提高土壤速效氮、磷、钾的含量，最终显著提高植物的肥料利用率［40－41］。

综上可知，植物促生菌的促生效果仅仅依靠某种单一的促生途径是无法实现的，通常通过几种机制共同来发挥促生作用，并且促生效果与寄主植物以及土壤特性的综合作用都有关系。PGPR复合菌肥的使用为岷山红三叶增产提供了有效途径，将PGPR与化学肥料配合使用的生产方式可以减少对非再生能源的大量消耗，减轻对农业生态环境的破坏，对于提高农产品品质，食品安全性和可信度，保障农牧业可持续发展具有积极意义。然而，促生菌肥的应用效果除了与施用区气候特点、土壤状况有关，还受到包括菌种来源、菌剂组成、施用量等因素的影响。因此，在本研究的基础上进一步探索PGPR微生物菌肥对岷山红三叶的促生机理及其对土壤特性的影响，并优化各类影响因子，以期制备最佳的生物菌肥，选择更适宜的化肥与菌肥配比，便于大面积推广使用，为实现岷山红三叶的环保型优质高产提供技术支撑。

4 结论

本研究对甘肃岷县地区获得的植物根际促生菌进行筛选，获得6株优良根际促生菌及1株根瘤菌，按照一定的比例混合制作根际复合微生物菌肥，并将其应用于岷山红三叶，盆栽试验结果表明：75%化肥＋菌肥处理使岷山红三叶干草总产量较CK增加4.76%，50%化肥＋菌肥处理在没有显著影响岷山红三叶总干草产量的情况下可节省一半化肥。75%化肥＋菌肥的处理使红三叶中粗蛋白、粗灰分、钙、磷的含量较CK都有所增加，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维相对降低；50%化肥＋菌肥的处理虽然没有显著提高红三叶的营养品质，但有助于减少化肥用量。通过测定各处理的岷山红三叶异黄酮含量的结果表明采用微生物菌肥替代50%化肥的处理并没有对4种异黄酮的含量造成显著影响，但却节省了50%化肥成本。

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