车轴草属植物异黄酮分析和比较研究

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(长春中医药大学药学院，药物材料合成设计实验室，长春 130117)

车轴草属植物异黄酮分析和比较研究

胡冬华，闫娜，何振洋，许士杰，钟婷，赵珊珊，和东亮*

(长春中医药大学药学院，药物材料合成设计实验室，长春 130117)

目的 形成吉林省红、白车轴草异黄酮成分提取、分离、纯化方法，进行车轴草属植物异黄酮有效成分对比分析和研究。方法 用乙醇提取车轴草属植物异黄酮有效成分，采用溶剂纯化法精制异黄酮，采用紫外分光光度法进行总异黄酮含量测定及提取工艺优化研究。结果 车轴草属植物含有刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素、染料木素及大豆苷元等，其中刺芒柄花素在车轴草属植物各部位含量丰富均衡，色谱分析结果稳定，可作为吉林省野生车轴草异黄酮成分分析标准品。结论 吉林省野生红车轴草药用植物中所含异黄酮种类丰富，白车轴草中含有染料木素、刺芒柄花素等异黄酮成分，研究结果有望为我省长白山地区野生车轴草药用植物资源开发利用提供指导。

红车轴草；白车轴草；异黄酮；葛根；比较研究

车轴草属植物所含的植物异黄酮有植物黄金之美誉，在预防和治疗更年期综合征、骨质疏松症、心脑血管疾病、抗癌等病中发挥功效，因此极具药品和保健品研发价值[1-5]。本研究拟对红车轴草与白车轴草异黄酮成分进行对比分析，优选和建立适宜的异黄酮纯化方法。采用色谱分析法，光谱法研究红、白车轴草异黄酮成分，优化相关工艺，确定最佳参数，为进一步开发白车轴草，扩大含有异黄酮的药用植物资源范围，提供实验支持和参考[6-9]。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 红车轴草和白车轴草样品2013年6月采自吉林省长春市净月经济开发区野外，经长春中医药大学药学院药用植物学教研室张景龙教授鉴定后，晒干、粉碎、过40目筛备用。

1.2 实验试剂 刺芒柄花素、染料木素、鹰嘴豆芽素、大豆苷元对照品，购自中国药品生物制品检定所,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯化铝均为分析纯,购自北京化工厂。

1.3 实验方法 准确称取一定量的已烘干、粉碎，40目过筛的车轴草置于圆底烧瓶中，采用乙醇水溶液加热回流提取和超声法提取。实验在预先设定的提取次数、提取温度、料液比以及提取时间下进行，待提取完成后，趁热过滤，然后将提取液减压真空浓缩，回收溶剂。将浓缩液干燥，得到车轴草总异黄酮浸膏。

1.3.1 提取工艺 探索并筛选出红车轴草中总异黄酮的提取最佳工艺。首先,通过单因素实验考察了总异黄酮的提取效果，然后，采用正交实验法进行优化，最终得到提取最佳工艺参数。

1.3.2 脱脂工艺 采用石油醚进行热回流脱脂实验,分别考察了脱脂次数、脱脂温度、脱脂时间以及料液比对红车轴草总异黄酮浸膏脱脂效果的影响，并通过正交实验进行优化，筛选出石油醚脱脂最佳工艺参数。

1.3.3 纯化工艺 根据黄酮类化合物自身的性质，采用J碱溶酸沉法及醇溶水沉法对红车轴草中总异黄酮进行了纯化工艺的研究，分别考察碱溶pH、酸沉pH、水沉加水量对异黄酮含量及浸膏得率的影响，得到最佳纯化工艺。

2 结果

2.1 回流提取法和超声法对比研究 考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比等因素，结果表明采用热回流提取法从红车轴草和白车轴草提取异黄酮的最佳工艺条件是：乙醇浓度75%，提取温度80 ℃，乙醇用量10倍(V/W),浸提时间1.5 h。采用超声提取法，超声功率为250 W。超声法设备简单，操作方便，时间短，效率高,无需加热，节省溶剂。

2.2 红、白车轴草异黄酮的对比研究

2.2.1 红车轴草异黄酮的提取 将红车轴草药材晒干，粉碎。取红车轴草粗粉14.27 g,加入62.00 mL甲醇溶液，超声提取30 min，2次。合并2次的提取液，过滤，除去药渣，在50 ℃将滤液干燥。干燥后称量得浸膏2.35 g。

2.2.2 白车轴草异黄酮的提取 将白车轴草药材晒干，粉碎。取白车轴草粗粉14.33 g,加入64.49 mL甲醇溶液，超声提取30 min，2次，合并2次的提取液，过滤，除去药渣，在50 ℃将滤液干燥。干燥后称量得浸膏2.08 g。

2.2.3 异黄酮的分离纯化 1)红车轴草异黄酮的分离纯化。将红车轴草浸膏用20 mL蒸馏水分散，每次加15 mL石油醚进行萃取脱脂共3次，取下层液体，置于干燥箱中干燥得浸膏1.07 g。用100 mL蒸馏水将浸膏溶解，用2 moL/L的氢氧化钠调节pH=8.5，并过滤得浅绿色滤液。再用2 moL/L的的硫酸调节pH=2.5，离心得沉淀。固体干燥后加适量乙醇溶解，加6倍量的蒸馏水离心得精制的针状异黄酮结晶，干燥后称重0.36 g。2)白车轴草异黄酮的分离纯化。将白车轴草浸膏用20 mL蒸馏水分散，每次加15 mL石油醚进行萃取脱脂共3次，取下层液体，置于干燥箱中干燥得浸膏0.73 g。分别用100 mL蒸馏水将浸膏溶解，用2 mol/L的氢氧化钠调节pH=8.5，并过滤得浅绿色滤液。再用2 moL/L的硫酸调pH=2.5,离心得沉淀。固体干燥后加适量乙醇溶解,加6倍量的蒸馏水离心得精制的针状异黄酮结晶，干燥后称重0.24 g。

2.2.4 异黄酮成分的检测 1)供试品溶液制备。分别取红车轴草和白车轴草乙醇提取物样品5 mg，加5 mL乙醇超声处理(功率250 W，频率50 kHz)10 min使溶解作为供试品溶液。2)对照溶液的制备。取刺芒柄花素对照品、染料木素对照品、鹰嘴豆芽素对照品、大豆苷元对照品各5 mg，分别加5 mL甲醇超声处理(功率250 W，频率50 kHz)10 min使溶解，作为对照品溶液。3)薄层色谱条件 分别选用甲酸-水-乙醇(0.2∶1∶4)，甲酸-水-乙醇(0.1∶1∶5)，甲酸-水-乙醇(0.1∶1∶4)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液(取三氯化铝0.1 g，加乙醇溶液10 mL使溶解，即得)，晾干，置紫外光灯(254，365 nm)下检视。

验证结果以甲酸-水-乙醇(0.2∶1∶4)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液(取三氯化铝0.1 g，加乙醇溶液10 mL使溶解，即得),100 ℃加热晾干置紫外灯下检视，此薄层色谱条件效果较好。

红车轴草供试品色谱中，在与鹰嘴豆芽素、刺芒柄花素、染料木素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。经反复试验表明红车轴草中含有鹰嘴豆芽素，染料木素，刺芒柄花素，大豆苷元。

白车轴草供试品色谱中，在刺芒柄花素、染料木素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，表明白车轴草中含有刺芒柄花素、染料木素。

通过红车轴草与白车轴草中总提取物与大豆苷元对照品、刺芒柄花素对照品、染料木素对照品、鹰嘴豆芽素对照品的薄层色谱检识可以发现，吉林省野生红车轴草和白车轴草含有相同的异黄酮成分包括丰富的刺芒柄花素和染料木素。

2.2.5 石油醚脱脂工艺 石油醚脱脂实验所筛选的石油醚脱脂工艺条件重现性良好,确定红车轴草总异黄酮浸膏脱脂最佳工艺参数为：脱脂温度50 ℃，料液比1∶7，脱脂时间0.5 h，脱脂次数3次。在此条件下，异黄酮脱脂效果较好，所得浸膏中总异黄酮含量平均为15.66%。

2.2.6 碱溶酸沉纯化异黄酮 经石油醚热回流脱脂后，红、白车轴草总异黄酮的含量提高，且所得浸膏易干燥，颜色呈黄绿色，易储存。碱溶最佳条件碱溶pH为8.5，酸沉最佳pH为2.5。

3 结论

本工作考察红、白车轴草异黄酮成分提取分离关键技术，以及化学溶剂精制法精制异黄酮的最佳工艺。研究表明红白车轴草均含有丰富典型的刺芒柄花素成分。解释和证明了采用刺芒柄花素作为标准品研究车轴草属植物中的异黄酮成分是合理可行的，可降低测试成本。

以提取的红白车轴草总异黄酮为原料，采用石油醚进行热回流脱脂，分别考察了提取次数、提取温度、提取时间、料液比对红车轴草总异黄酮浸膏脱脂效果的影响，筛选出石油醚脱脂最佳工艺参数。其最佳工艺参数为：乙醇浓度75%，料液比为1∶8，脱脂温度为80 ℃，脱脂时间为1.5 h。

采用碱溶酸沉法及醇溶水沉法对车轴草属植物中总异黄酮进行了进一步纯化，分别考察碱溶pH、酸沉pH、水沉加水量对异黄酮含量及浸膏得率的影响，得到最佳纯化工艺。该工艺为碱溶最佳pH为8.5，酸沉pH为2.5，加水量6倍量。

本研究首次对吉林省蛟河地区野生红车轴草及其同属植物白车轴草的异黄酮成分进行对比分析，为拓展含有异黄酮成分的药用植物资源提供实验依据，为异黄酮相关车轴草属药用植物开发提供依据，为车轴草属植物防治乳腺癌及更年期症状等雌激素相关领域疾病研究工作提供参考。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1998:329.

[2]马强,张金兰,周玉新,等.高效液相色谱-电喷雾质谱法测定红车轴草中异黄酮类化合物[J].分析化学,2006,34(增刊1):247-250.

[3]常平,张颍,夏开元,等.红车轴草提取物中异黄酮成分的分析[J].食品科学,2007,28(9):449-452.

[4]陈寒青,金征宇,陶冠军,等.红车轴草不同部位中异黄酮含量的测定[J].食品科学,2004,25(6):150-153.

[5]孙琳,李占林,彭静波,等.白车轴草化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2010(1):40-43.

[6]胡冬华,梁久来.红车轴草中异黄酮成分提取工艺优化和方法学研究[J].吉林中医药,2007,27(12):61.

[7]詹庆丰,夏增华,白海云,等.白车轴草化学成分研究[J].中国中药杂志,2005,30(4):311-312,320.

[8]梁冬,高艳辉,贾艾玲,等.玉米须总黄酮醇提工艺研究[J].长春中医药大学学报,2011,27(6):1046-1047.

[9]崔健,张英华,陈新,等.超滤技术与醇沉法在金钱草总黄酮纯化工艺中的比较研究[J].长春中医药大学学报,2009,25(6):959.

Analysisandcomparisonofisoflavonesintrifoliumplants

HU Donghua,YAN Na,HE Zhenyang,ZHONG Ting,ZHAO Shanshan,HE Dongliang*

(Medicinal Materials Synthesis & Design Lab,College of Medicine,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117)

ObjectiveTo form ingredient extraction,separation and purification methods of Jilin province’s isoflavones contained in Trifolium plants,process the study of analysis and comparison the effective element of Trifolium pratense and Trifolium repens isoflavones.MethodsWith ethanol extraction plants of the Trifolium isoflavones active ingredients,using solvent purification method of refined isoflavones,and Using ultraviolet spectrophotometry for determination of total isoflavones content and extraction process optimization research.ResultsTrifolium plants contains mans handle,flowers,olecranon bean sprouts element A,genistein and daidzein yuan,etc.,including sting mans handle,the rich content in each part of the plants of the genus clover equilibrium,chromatographic analysis result is stable and can be used as A wild clover isoflavones composition analysis of jilin province standard.ConclusionTrifolium pratense herb of jilin province with rich plant contains isoflavones,the Trifolium repens contains genistein,mans handle,the composition of isoflavones,the results of the study is expected to the changbai mountain area of sichuan province guide axle wild herbs with the development and utilization of plant resources.

trifolium pratense;trifolium repens;isoflavones;puerariae;comparison

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.023

吉林省中医药管理局中医药科技项目(YJS-0207)；吉林省卫生厅科研项目(20112067)；国家级大学生创新创业训练计划项目(20131099046)。

胡冬华(1977-)，女，博士，副教授。研究方向：药物有效成分分析与合成设计研究。

] 和东亮，男，博士，讲师，电话：13604438860，电子信箱：hudonghua8888@126.com。

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：2095-6258(2014)05-0822-03

2014-05-03)

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