药物诱导肿瘤细胞有丝分裂灾难机制研究

曲中原，邹 翔，龙丽莉，王 超，王雨蒙，王嘉琪

(1.哈尔滨商业大学药物所博士后科研工作站，哈尔滨150076;2.齐齐哈尔富拉尔基区中医医院，黑龙江齐齐哈尔161041;3.哈尔滨商业大学抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心，哈尔滨150076)

有丝分裂灾难(mitotic catastrophe)这一概念最初是在1989年由Molz等人提出，他们在研究一种对温度敏感的裂殖酵母突变体中发现细胞分裂时因染色体异常分离而死亡[1].从发现有丝分裂灾难死亡现象至今已经20多年，但是人们对它的了解还十分有限，其中一个关键的原因就是对于有丝分裂灾难的认识缺乏一致的辨别标准.最初一些人认为，有丝分裂灾难不是一种细胞死亡形式，而是引起细胞死亡的一种不可逆的中间过渡状态，而最终细胞死亡是通过凋亡、坏死或衰老等途径[2].近年来随着深入研究，有丝分裂灾难越来越趋向于被认为是一种由细胞损伤和细胞周期检查点异常引起的一种新的细胞死亡途径，具体机制尚在研究和探索中.

1 有丝分裂灾难的特征

当细胞DNA损伤或纺锤体结构破坏时，有丝分裂发生异常，细胞无法完全分裂，导致四倍体或多倍体并伴有细胞死亡的现象称之为有丝分裂灾难[3].与凋亡、坏死或衰老等不同，有丝分裂灾难死亡的特征主要表现在细胞死亡发生在错误的有丝分裂期间或之后，有丝分裂期异常;细胞体积变大，形成的巨细胞中含有两个或多个核和部分凝集的染色质;DNA多倍化;中心体异常复制，出现多中心体现象等[4].相关基因变化表现为G2/M期检查点和有丝分裂纺锤体组装相关蛋白质的低表达或缺失，caspase激活或不激活.检测方法主要有光学显微镜或激光共聚焦显微镜或电镜检测细胞含两个或多核.流式细胞仪检测G2/M阻滞，多倍体[5].从这些特征分析有丝分裂灾难死亡发生在细胞有丝分裂期的不同阶段，但主要是长时间的中期阻滞所引起.当纺锤体检查点出现异常，损伤的遗传物质异常分配形成多核后，就能启动有丝分裂灾难死亡通路.

2 有丝分裂灾难与G2/M期检查点

研究表明有丝分裂灾难与G2/M期检测点有着密切关系，G2/M检测点异常时，期细胞不能正常分裂，导致四倍体或多倍体的形成，细胞失去活性并伴有死亡现象.

2.1 cdc2/cyclinB1 复合物

有丝分裂期的启动是由cdc2/cyclinB1复合物控制.G2到M期的进程是由激活的cdc2/cyclinB1复合物所驱动的.cdc2/cyclinB1异型二聚体被激活后，有丝分裂被启动，其活性从有丝分裂的前期必须维持到中期之前.进入后期，cdc2/cyclinB1的活性由于cyclinB1的降解而崩解.分裂期开始时，cdc25c使cdc2的赖氨酸15位点(Tyr15)和苏氨酸14位点(Thr14)去磷酸化，从而活化cdc2/cyclinB1复合物活力，细胞开始分裂.当cdc25c的丝氨酸216位点(Ser216)被磷酸化后，14－3－3蛋白将cdc25c束缚在胞浆中，从而干扰cdc25c对cdc2的去磷酸化，进而使cdc2/cyclinB1复合物活力降低.

研究表明有丝分裂灾难与M期cdc2/cyclinB1复合物活力下降有关.在土槿皮乙酸诱导小鼠成纤维L929细胞周期阻滞的研究中发现，土槿皮乙酸作用细胞0－24h cdc2蛋白水平无明显变化，而cyclinB1蛋白水平与时间成正比上升;24 h后cdc2蛋白水平有所下降，而cyclinB1急剧下降.cyclinB1的降解导致cdc2/cyclinB1复合物活力降低使L929细胞阻滞于M期，最终发生有丝分裂灾难[6].在白屈菜碱诱导人胃癌SGC－7901细胞有丝分裂灾难的研究中发现，药物作用48 h后cdc2和 cyclinB1 蛋白水平均下降[7－8].

2.2 Plk 激酶

在Plk(Polo－like kinase)激酶家族中，Plk1在细胞分裂中具有最广泛的功能，它在有丝分裂过程中对染色体的分离、中心体的复制、纺锤体的形成、胞质的分裂都有重要的作用，是染色体DNA复制必不可少的激酶类[9].应用RNA干扰技术(RNAi)抑制人胃癌MKN－45细胞Plk1基因的表达，结果发现，Plk1mRNA及蛋白质水平在一定时间内均明显降低，更多的MKN－45细胞阻滞于G2/M期，细胞无法从G2期过渡到M期，或进入了M期却不能完成分裂[10].在食管癌细胞的研究中，使用RNA沉默技术抑制Plk1的表达，可导致姐妹染色单体分离不彻底和胞质分裂失败，使细胞发生有丝分裂灾难[11].目前研究结果提示Plk1可能将会是今后具有潜在临床应用价值的药物或基因抗癌靶点.

3 有丝分裂灾难与纺锤体组装检查点

纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint，SAC)工作始于细胞进入有丝分裂后期直到所有染色体都正确排列，它监控着微管的结构、染色体附着情况，并在有丝分裂纺锤体装置正确配置前延迟姐妹染色单体分离.着丝点相关蛋白Mad2，BubR1，Bub1和Bub3是纺锤体检查点信号通路的关键组分.这些蛋白可以附着于没有结合微管的着丝点上，从而在纺锤体功能失调时阻止有丝分裂进入后期.细胞进入M期后，能否跳出M期完全由SAC控制.任何干扰姐妹染色体与纺锤体正确结合的因素都会激活SAC.正常情况下，进入M中期的细胞会迅速激活后期促进因子(anaphas－promoting complex，APC)，破坏姐妹染色单体的粘连，使相关cdks复合物失活，从而完成有丝分裂和胞质分裂.由于SAC对微管蛋白动力作用、中心体分离异常、中心体和动粒结构的变化及严重的DNA损伤敏感，所以各种因素都直接或间接的激发SAC信号，APC失活，导致细胞阻滞于M中后期的交界处[12].然而，有丝分裂灾难之所以发生，形成多核细胞，是由于细胞发生了有丝分裂滑脱.有丝分裂滑脱是指细胞发生了SAC适应，在没有彻底修复已损伤的纺锤体的情况下，能够越过，突破该检查点，跳出直接至下一个细胞周期的G1期，形成4倍体或多倍体的假G1细胞.这种细胞失去了分裂能力，维持在G1期，具有多个微核，可以存活数天但不具细胞活性，数天后通过衰老或凋亡死亡.这种现象的产生和cyclinB1降解、cdc2/cyclinB1失活，cdk抑制分子的作用密切相关[6].有丝分裂灾难细胞有多种命运，例如死于分裂期，进入下一个周期的G1期后再死亡和有丝分裂滑脱跳出分裂期进入衰老状态[3].最新研究发现一种从鸡贫血病毒(CAV)中获得的病毒蛋白凋亡素可选择性地诱导人类肿瘤细胞死亡.它在在骨肉瘤细胞中通过非p53途径使纺锤体形成异常，并使有丝分裂期的非双极主轴细胞增加了10倍，使有丝分裂周期加长出现异常核分裂，从而诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难死亡[13].另有研究发现212Pb放射免疫疗法也是通过干扰有丝分裂纺锤体检查点从而加强紫杉醇诱导细胞发生有丝分裂灾难死亡[14].

BubR1是酵母细胞有丝分裂检查点基因家族中的一员，其编码的蛋白是纺锤体检测点的重要组成成分之一.BubR1通过参与监测有丝分裂过程中微管与着丝点间的结合状态，感受着丝点上张力的情况来确保染色体的正确分离以及细胞有丝分裂过程.BubR1的表达水平与纺锤体检测点的功能存在一定的剂量依赖效应，该基因一旦缺失将引起大量非整倍体的产生，从而引发纺锤体检测点的妥协反应.近来有关BubR1的功能和作用机制等方面引起了越来越多研究人员的关注[15].BPR0L075[6－ 甲氧基 －3 － (3＇，4＇，5＇－ 三甲氧基苯甲酰基)－1H－吲哚]是一种新合成的微管抑制剂，具有高效和广谱的细胞毒作用，对卵巢癌细胞及耐紫杉醇药的卵巢癌细胞均有较好的效果[11].其作用机制一方面是诱导细胞凋亡，另一方面是上调耐紫杉醇的卵巢癌细胞cyclinB1，BubR1以及MPM－2和Survivin蛋白水平，使Bcl－XL磷酸化进而发生G2/M期阻滞，形成多核巨细胞，发生有丝分裂灾难.从民间抗肿瘤草药旱生香茶菜(Isodon xerophilus)中分离得到的化合物Pharicin A是贝壳杉烯二萜类化合物.研究发现Pharicin A能够诱导白血病和实体肿瘤细胞发生有丝分裂灾难.其作用机制与染色体排布异常、BubR1定位异常和解除纺锤体检查点的检测有关.此外，Pharicin A也可诱导紫杉醇耐药的人类白血病细胞Jurkat和人骨肉瘤细胞U－2OS发生有丝分裂灾难[16].

4 诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难的相关药物

紫杉醇在卵巢癌和乳腺癌的治疗中起主要作用，主要通过促进微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白稳定.半合成紫杉类抗肿瘤药物多西紫杉醇用于治疗乳腺癌和前列腺癌，抗肿瘤活性比紫杉醇高[17].其作用机制也可通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络，促进细胞发生有丝分裂灾难死亡而起到抗肿瘤作用.帕唑帕尼能有效的抑制细胞周期调控的相关激酶，紫杉醇与其结合可产生协同抗肿瘤作用，其增效与有丝分裂灾难有关[18].Zuryń A 等[19]用不同浓度的阿霉素(0.05，0.1 和 0.15 μmol/L)作用于人类白血病细胞Jurkat，发现低剂量治疗后，Jurkat细胞出现G2/M期阻滞，cyclinB1，cyclinA和cyclinD1蛋白表达量升高，进而出现细胞凋亡和有丝分裂灾难.肾茶(Clerodendranthus spicatus)中的有效成分泽兰黄素可以非特异性抑制许多蛋白激酶，使细胞有丝分裂不能正常进行，发生细胞G2/M期阻滞，诱导有丝分裂灾难[20].

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