细菌生物膜形成及相关耐药性治疗研究进展

温绍霞，孙 竞

(1.十堰市西苑医院检验科，湖北 十堰 442000；

2.湖北医药学院附属太和医院检验科，湖北 十堰 442000)

细菌生物膜形成及相关耐药性治疗研究进展

温绍霞1，孙 竞2

(1.十堰市西苑医院检验科，湖北 十堰 442000；

2.湖北医药学院附属太和医院检验科，湖北 十堰 442000)

生物膜是细菌在其生长过程中为了适应周围环境而形成的一种保护性生存状态。细菌以生物膜形式存在时其耐药性明显增加。近些年来，广谱抗生素的广泛使用伴随着细菌生物膜的形成，给临床治疗带来严峻的挑战。本文就当前生物膜形成过程、调控机制及相关治疗措施等方面的研究进展作一综述。

细菌生物膜；耐药性；形成过程；调控机制；治疗措施

感染性疾病与传染性疾病是目前导致人类死亡的重要病因。在细菌感染过程中，与其致病力密切相关的主要包括各种毒力因子。近年来的研究发现除此之外，生物膜的形成也是很多细菌致病性与产生耐药性的原因之一。对于肺炎克雷伯菌，很多临床分离株在体外和体内都能够形成生物膜，肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性与细菌在聚苯乙烯及呼吸道上皮细胞上的粘附力相关。

细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而粘附于物体或活性组织表面，并包被于其自身产生的细胞外多糖基质中形成的一种与浮游细菌生长方式完全不同的细菌微生物群落，是细菌的特殊存在形式。许多细菌形成生物膜形成后所表达的基因产物与浮游细菌不同，细菌的生理状态以及形态[1]也不相同，这使它的适应能力比浮游细菌更强。生物膜是细菌适应环境而采取的一种生存策略，是抵抗机体防御和限制抗菌药物接近细菌的天然屏障。生物膜的形成一方面促进细菌逃避机体免疫系统的作用[2]，阻碍细胞吞噬或减少吞噬作用与氧活性降低后的应激反应；另一方面可以阻止或延缓药物的渗透，生物膜内细菌的生理学特点影响了细菌对药物的敏感性[3]。

由于某些致病菌主要是在人体内外和医疗材料表面形成细菌生物膜，抗生素可以杀灭浮游细菌，而处于细菌生物膜深处的细菌却难以被清除，这也是慢性感染性疾病发作反复和难以控制的原因之一。例如在肺炎克雷伯菌致病过程中，由于生物膜的形成致使感染经常呈现静止期与急性发作期交替、易复发、难根治等特点。细菌生物膜的形成已成为全球关注的热点问题，本文将就生物膜形成过程，调控机制及相关治疗措施等方面的研究进展综述。

1 细菌生物膜的形成过程及调控机制

生物膜是细菌、真菌、原虫被它裹在其自身分泌的多聚物种所形成的一种特殊的细菌群落，具有高度的组织性与系统性。生物膜的形成是多因子共同作用的结果。无论微生物表型的结构如何，以及涉及的细菌种类如何复杂，生物膜的形成是一个动态的高度依赖于环境信号的过程，整个过程包括开始、成熟、维护和分解四个阶段[4]。在生物膜形成过程中，细菌首先粘附于固体的表面，这样才能够形成成熟的生物膜，因此细菌生物膜从游离的单个细胞到形成成熟的生物膜的重要阶段是开始吸附到附着物表面。随着微菌落的不断形成以及细菌的粘附并定植在宿主皮肤、黏膜上皮细胞，然后侵入组织细胞生长繁殖，分泌水、胞外多糖、蛋白质等物质，将其本身包裹其中，生物膜不断增厚，发展成熟。虽然生物膜一般处于静止状态，但是它仍属于一个动态过程，生物膜聚集和成熟之后，其中有一小部分细胞可能会离开成熟的生物膜，并将其扩散传播到远处，因此，在生物膜传播相关感染中细菌生物膜的分离释放具有重要的作用[5]。胡金树等[6]认为细菌从细菌生物膜脱离，主要依靠外界的作用力，或者自我分离播散到其他环境，从而引起感染。

生物膜的形成是高度依赖于基因调控集网络浮游生物之间的转换。这些网络集成环境通过适当的传感系统触发的信号适当的反应，包括双组分信号转导通路与密度感应系统等(QS系统)。双组分系统(TCS)和EC信号转导通路的主要信号是由细菌监测外部和内部的刺激（例如营养素、离子、温度、氧化还原状态），并把这些信号转换成自适应反应。QS系统也称为密度感应系统，是细菌感受菌体密度的一种环境感应系统。密度感应系统对生物膜的形成及维持具有重大意义，它可以使生物膜中的营养物质、酶、代谢产物和废物正常的运输和排出，而且整个细菌群体行为也需要通过密度感应系统来控制并协调，共同对周围环境刺激做出反应，整个细菌群体的生存能力得到极大的提高。QS系统通过自分泌的小分子信号调节生物膜形成[7-8]。AHL是已被证实的革兰氏阴性菌群体感应系统最常见的生物膜细胞间信息传递分子，在形成和维持细菌生物膜的三维结构中，AHL起着关键作用。高丝氨酸内酯环是这类化合物的共同特征，不同细菌都含有相同的高丝氨酸内酯环，而酰基侧链中的碳链长度(从4到18个)和第三位上的基因(氢，羟基，羧基)决定该类信号分子对细菌的不同调控作用[9]。当多个细菌集中在一个部位时，由于环境浓集，AHL的浓度会升高，达到一定阈值时，可以与细胞内的蛋白受体结合并激活受体，调节细菌体的某些功能基因的表达，导致细菌分泌出构成胞外基质的糖蛋白复合物，形成细菌生物膜完整的结构。在大多数革兰氏阳性细菌中，群体感应系统(QS)的信号分子是产生修饰后寡肽，信号识别系统的组成是双组分磷酸激酶，当信号识别分子膜上激酶识别后，引起氨基酸残基磷酸化，由天冬氨酸残基传递，磷酸基因被传递给受体蛋白，于是此受体蛋白与DNA特定靶点结合，调控QS系统。革兰氏阳性菌的群体感应系统可对多种细菌行为进行调控，如枯草芽胞杆菌的产芽胞、肺炎球菌中致病基因的表达。

2 细菌生物膜感染的耐药性

由于生物膜细菌与浮游细菌不同，其耐药性也不一样，生物膜内细菌对抗菌药物敏感性低于游离状态。

周洁等[10]认为细菌耐药机制有以下一种或几种原因：(1)抗生素对生物膜渗透限制性：各种分子在生物膜的类型包括EPS和DNA构成了一个抗菌屏障。研究表明喹诺酮类药物可以很快进入到铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部[11-12]，反复、长期使用利于细菌启动内酰胺酶的表达，使耐药发生突变，水解内酰胺酶类抗生素。(2)生物膜中微生物的异质性：生物膜内化学微环境存在差异，生物膜内由表及里的氧气浓度、pH值、营养物质及渗透压存在梯度变化，决定了其内细菌对抗生素表现出不同的敏感性[13]，使生物膜表现出耐药性。(3)生物膜生长模式的生理变化性：Adams等[14]发现有rpos表达阳性的E.coli生物膜有大量的高密度活性细菌，这可能是由于细菌在缺乏营养或聚集较多的有毒代谢物质等条件下生长缓慢，rpos基因被激活。细菌生物膜中有一部分细菌分化为类芽胞生长状态，这类亚群细菌具有广谱的耐药性。此外，近年来研究表明，生物膜内细菌可通过主动外排机制及细菌间的感应系统，调节抗生素与细菌体内的作用位点，从而在生物膜抗药机制中有一定的作用。生物膜通过减少细胞因子的产生、诱导补体转化等方式对抗机体免疫防御。王云英等[15]曾报道肺炎克雷伯菌细菌生物膜抑制THP-ITLR2蛋白水平的表达，TLR2激活抗原呈递细胞能力降低，减少细胞因子(TL-8和TL-12)和化学激活因子的产生，使机体免疫功能下降。

综上所述，细菌生物膜耐药性的产生可能是多方面因素共同作用的结果，主要依据不同发展阶段的生物膜，菌种(株)的不同及抗生素的类型而定。

3 细菌生物膜相关感染的防治

3.1 抗菌生物材料 细菌生物膜的形成大多与生物医学材料有关，在生物膜材料中加入抗菌药物可抑制表面生物膜的形成，用铸膜的方法在形成硅胶的前提下加入利福平，可明显抑制硅胶表面表皮葡萄球菌粘附和生长[16]。选用低表面能材料（如特氟龙、高弹力硅胶或聚乌拉坦等）可使生物膜相关的感染发生率降低。聚乙二醇是亲水聚合物排斥体积及反渗透压均很大，可以产生强的抗细菌粘附能力，常被用来做表面改良剂[17-18]。经聚乙二醇涂附的生物材料对大多数革兰氏阴性菌有很好的抗菌作用。

3.2 抑制细菌QS系统 不同的细菌在不同群体感应系统，如葡萄球菌有Agr群体感应系统。铜绿假单胞菌有lasR和rhlR群体感应系统，N-酰基高丝氨酸内脂作为群体感应信号，除了参与生物膜的合成外，还与细菌素性因子的产生、抗生素的合成或降解、质粒结合转移等多种生物功能有关，并且可以诱导宿主细胞的凋亡[19]，是导致细菌持续或反复感染的重要分子。实验发现氨溴索下调铜绿假单胞菌群体感应系统信号分子N-酰基高丝氨酸内酯以及N-酰基高丝氨酸内酯合成酶编码的基因的表达，并且能增强抗生素对细菌生物膜的渗透作用[20]，还能破坏成熟的细菌生物膜结构[21]。因此，抑制细菌的群体感应信号，将成为控制感染合成新型抗菌药物的重要方法。

3.3 抗生素药物 氟喹诺酮类药物与大环内酯类药物联合使用可以有效抑制细菌合成多糖蛋白复合物，从而抑制生物膜的形成。对于慢性感染中的生物膜，Wallwork等[22]研究发现大环内酯类抗生素对治疗鼻窦炎有效。但是由于生物膜具有独特的耐药性，埋藏的细菌能抵抗抗生素，在体内继续存在，导致感染再次发作，造成患者病情反复，难以治愈。

3.4 中草药 中草药可抑制细菌生物膜的形成，与抗生素联合应用可增强抗生素的抗感染能力，并且中药价格低廉，来源广泛，毒副作用小，不容易导致细菌耐药，在菌体内作用广，药理效应多，在防治细菌生物膜引起的感染方面具有独特的优势。孔晋亮等[23]研究了黄芩水煎液联合左氧氟沙星或头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的作用，结果显示黄芩水煎液可抑制，破坏铜绿假单胞菌生物膜，并且与左氧氟沙星或头胞他啶联用后生物膜内活菌数量减少，表明黄芩水煎液本身破坏细菌生物膜，同时对左氧氟沙星和头孢他啶有增效作用。本课题组经实验发现终浓度为30µg/ml黄芩素可减慢肺炎克雷伯菌生长速度，减少肺炎克雷伯菌对载体的吸附，抑制和清除肺炎克雷伯菌细菌生物膜。

3.5 超声 实验研究表明，低频超声结合抗生素可有效增强抗生素治疗游离细菌及生物膜细菌感染的活性[24]。Qian等[25]报道了应用低强度超声辐照铜绿假单胞菌24 h后，发现超声能显著增强抗生素活性对抗生物膜，提高其抗菌活性。

3.6 其他 抗体作为一类主要的蛋白质药物目前应用的较为广泛，Anti-asialoGM抗体能降低铜绿假单胞菌在肺囊纤维化上皮细胞的粘附[26]。而人类免疫球蛋白IgG能降低铜绿假单胞菌在隐形眼镜和角膜细胞表面的粘附[27]。段高飞等[28]研究发现一种海洋弧菌胞外多糖，其不仅能够抑制细菌生物膜的形成，还能破坏逐渐形成的生物膜，增加抗生素对生物膜细菌的杀灭效果，作用更加广泛。

4 结 语

细菌生物膜存在于慢性感染及植入装置相关性感染中，尽管人们应用多种方法来防治细菌生物膜感染，并取得了一定的成效，但是随之而来的是可能会带来“超级细菌”的出现。因此，随着对细菌生物膜的深入研究，今后防治生物膜感染的研究方向不应只集中控制细菌生物膜的形成，而应针对细菌生物膜感染的发病过程研究更好的治疗方法。

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1003—6350（2014）09—1331—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0512

2013-10-21)

温绍霞。E-mail：2603384011@qq.com