早产动物GMH-IVH模型的制作

暴丽莎 郝玲 刘芳 任常军

·综述与讲座·

早产动物GMH-IVH模型的制作

暴丽莎 郝玲 刘芳 任常军

生发基质-脑室内出血；模型，动物；早产

随着围产技术及重症监护技术的提高，目前越来越多的早产儿得以存活。因此，早产儿的神经系统后遗症日渐成为人们首要关注的问题之一[1]。生发基质-脑室内出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricular hemorrhage，GMH-IVH)是早产儿主要的脑损伤形式[2]。根据文献报道在胎龄<32周或(和)出生体重<1 500 g的早产儿中GMH-IVH的发生率为20%左右，其中Ⅳ级出血占8.3%[3]。出生体重为500～750 g的超低出生体重儿GMH-IVH的发生率高达45%[4]。我国早产儿GMH-IVH的发生率明显高于发达国家。我国早产儿GMH-IVH的发生率为56.6%，其中重度出血的发生率为16.3%，并且存活者约35%遗留慢性神经障碍。GMH-IVH后出现的主要神经系统后遗症包括脑性瘫痪、癫痫、学习困难和认知异常等[5]，因此GMH-IVH是早产儿早期死亡的主要原因，也是早产儿以后智力、运动发育障碍的主要原因。这些不仅给家庭、社会带来沉重的经济负担，还给家庭带来沉重的心理负担。目前GMH-IVH造成的脑损伤机制还在研究中，同时在临床治疗中GMH-IVH无特效疗法，主要依靠支持疗法，许多新的治疗办法还有待于验证[6]。GMH-IVH动物模型的建立是解决这些问题十分有效的途径。当前存在的主要问题是如何建立较为标准的GMH-IVH动物模型，它不仅在出血后形态学及病理生理机制上要接近人类早产儿，还要具有价格合理、容易复制和操作的优点。2008年美国Georgiadis等[3]首次报道了该类动物模型的建立及相关研究。目前在国内相关研究中尚无标准GMH-IVH动物模型用于描述这种GMH-IVH后的急性脑损伤。本文综述了近年来在国内外各类文献中应用的GMH-IVH动物模型，以供大家参考，同时对国外建立的早产动物GMH-IVH模型进行介绍，希望可借助此动物模型对早产儿GMH-IVH进行更加深入、细致的研究。

1 早产儿脑出血的类型及机制

1.1 新生儿脑出血根据出血部位主要分为四种类型：(1) GMH-IVH；(2)硬脑膜下出血；(3)蛛网膜下腔出血；(4)小脑出血。GMH-IVH是早产儿最常见的脑出血类型。

1.2 早产儿脑出血与成人脑出血机制不尽相同，目前早产儿GMH-IVH造成的脑损伤机制还在研究中，大多数研究认为早产儿GMH-IVH是多种原因共同作用的结果[7]，最主要的原因被认为是[8]：(1)早产儿生发基质脉管系统的脆弱性：毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接、基膜、星形胶质细胞足突、周细胞和极狭小的细胞外隙共同构成了血-脑屏障，这些成分中，任何一处存在薄弱或受损，均有可能导致颅内压升高，引起GMH-IVH[7]。(2) 脑血管内血流量的波动：早产儿的脑出血好发于室管膜下的生发基质。室管膜下生发基质的血液供应来自于大脑前动脉及中动脉，在此处形成供血丰富的毛细血管床，且来自脑白质，脉络丛，纹状体的多条静脉在尾状核头部位汇合成端静脉，形成“U”字形回路，这种特殊的走形极易发生血流动力学的变化而致出现脑出血。(3)早产儿血小板及凝血功能障碍：新生儿肝脏功能不成熟，凝血因子生成不足，凝血功能较差，且目前通过研究发现，凝血功能与胎龄有关，胎龄越低，凝血功能低下程度越严重，越易发生GMH-IVH。此外一些影响因子如缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起紧密连接结构及功能发生改变造成血脑屏障损害，从而导致血脑屏障通透性升高引起脑水肿、脑出血。早产儿生后易受血糖、血压、氧分压、二氧化碳分压、机械通气等因素的影响，尤其高碳酸血症时，可扩张脑血管，从而增加脑血流，导致GMH-IVH的发生[9，10]。由此可见，早产儿GMH-IVH与成人脑出血发生机制的不同，建立的GMH-IVH模型要与早产儿GMH-IVH的机制具有临床相似性，以便为进一步研究早产儿GMH-IVH后的急性脑损伤奠定研究基础。

2 GMH-IVH模型实验动物的选择

许多动物如兔、犬及啮齿类动物被用来制作GMH-IVH动物模型，但是目前尚无一种动物模型能模拟早产儿GMH-IVH后所有的病理生理及神经行为的变化，且在对动物的选择上，每种动物均有自己的优缺点。无论何种实验动物，制作模型的目的是希望其出血后脑组织的形态学变化及病理生理的改变与早产儿GMH-IVH具有良好的相似性。目前国内外用以建立GMH-IVH常用的实验动物有啮齿类动物(如大鼠)、灵长类动物(如猩猩)、以及兔、猫、狗等多脑回动物。灵长类动物如猕猴、猩猩等，与人类脑成熟度及其损伤形式具有很高的一致性，能准确反应人类新生儿的损伤机制及神经病理情况，可提供用于人体实验前极有价值且安全有效的方法和实验数据，但因其价格昂贵，数量有限，此模型的应用受到了限制，不适合进行大量的基础研究。大鼠繁殖快、价格低廉，体积小，易于管理，喂养，可被大量的用以实验研究，且大鼠的脑血管解剖及生理与人类较为接近，同时目前大量科研工作多用大鼠，已积累了大量关于大鼠的生理、病理等方面的实验资料。但是大鼠为啮齿类动物，属于单脑回动物，此点与人类不符合，且大鼠的体积小，GMH-IVH后的影像学的评价较为困难。应用早产兔进行GMH-IVH模型制作的优势在于其许多方面与人类有相似之处：(1)脑组织生长极限发生在围产期，这与人类相似，常用于脑损伤后的运动研究；(2)脑基质含量十分丰富；(3)脑血流通过颈内动脉和椎动脉；(4)肺的完全成熟发生在胎内，这使它们即使是早产兔，也有能力存活；(5)它们有发生自发性GMH-IVH的风险；(6)家兔基底节发达，而基底节是人类GMH-IVH的好发部位，同时家兔体积大，其GMH-IVH后的影像学的评价也较为方便。此外家兔价格相对低廉，兔子妊娠期为30～32 d，孕周29 d的兔子生理上属于早产兔，较容易获得，因而适合作为研究人类早产儿GMH-IVH的动物模型。

3 常见的脑出血动物模型

笔者尚未见到我国目前早产动物GMH-IVH模型研究的报道，很多实验研究显示了目前人们建立的成年动物脑出血模型。比较常见的为成年大鼠或家兔脑出血模型的建立，常见的脑出血模型包括四种：(1)自体血或血凝块脑内注入脑出血模型。20世纪60年代就开始应用此法进行脑出血模型的建立，随着立体定位技术的问世，使此法更加完善。此法可通过立体定位技术建立我们所需要的脑出血模型，同时可通过控制血液注入量制作分级实验性脑出血的研究，这种模型的制作接近临床脑实质的出血，可用于更好的观察脑实质出血后的病理形态学特点，但注入的血量与血肿产生的大小没有确定的关系，所以此实验重复性较差，而且即使有立体定位仪，注入血可能进入蛛网膜下腔，引起脑实质的潜在损伤[11]。(2)脑内植入填充物脑出血模型。此模型填充物大多应用微球囊。但此种方法为单纯机械性损伤，不能进一步模拟脑出血后脑细胞及其神经的病理生理变化，目前此法较少应用。(3)脑内注入胶原酶诱导脑出血模型。此法制作模型快捷且重复性好，肝素化的胶原酶能够破坏血脑屏障，与人类脑出血的病理生理学有许多相似之处，但血肿形成时间过长，病理上类似出血性脑梗死，与脑出血后急性脑损伤不相同，因此此模型的应用受到限制。(4)自发性脑出血模型。此模型中使用一种为应用血压表型为标志近交培育的自发性高血压大鼠，但此种大鼠培育不便，应用受到很大的限制。第二种为肾型高血压大鼠，但是此法造成脑出血的发生率及部位不稳定，使其应用受到限制。

国内目前建立的脑出血动物模型基本上使用的是成年动物，从病理生理上也是为进一步模拟成年人脑出血后脑损伤的病理生理变化情况。但是早产儿作为特殊的群体，其脑出血的机制与成年人脑出血的机制不同，脑出血后造成的急性脑损伤亦与成年人有差别，成年动物脑出血模型不能直接被用来研究早产动物脑出血的机制。同时有实验指出可应用缺氧或高碳酸血症造成脑血管扩张，血流量增多，从而建立脑出血动物模型。但是这种实验力度不易掌握，且容易造成动物死亡，复制困难，使实验失败。因此需要寻找一种安全的，更为接近早产儿脑出血发生机制的动物模型。

4 国外已建立的早产动物GMH-IVH模型

丙三醇(俗称甘油)，是一种高渗溶液，是对硝基化合物的终产物，分娩时或分娩后快速腹腔注射丙三醇，使脑组织血浆渗透性急剧增加，组织间水分向血浆转移，血流量增加，严重者出现脑组织血管破裂，引起新生动物颅内出血[12]。更为重要的是，丙三醇对模型动物无直接脑损伤和肝、肾、肺、心等其他重要脏器毒副作用。在大鼠腹腔注射丙三醇实验中，研究者检测动物血浆肌酐、血尿素氮及电解质，发现丙三醇并没有对肾小管上皮细胞造成任何损害[13]。有相关实验研究发现腹腔或静脉注射丙三醇后不会产生神经细胞的毒性，对脑组织内谷氨酸、丙酮酸的代谢无影响。甚至有关于应用静脉注射丙三醇治疗缺氧性脑水肿、脑肿瘤等方面的报道[14，15]。利用腹腔注射丙三醇建立的早产兔GMH-IVH模型，与早产儿GMH-IVH发病机制及GMH-IVH后的脑损伤具有临床相似性。

2008年Georgiadis等[3]通过向早产兔腹腔注射丙三醇建立了GMH-IVH的早产兔动物模型。通过对孕29 d(足月为32 d)的孕兔进行剖宫产，将生后3 h的早产兔腹腔注射50%丙三醇，建立GMH-IVH模型。对此模型进行超声影像学评价，发现约80%左右的早产兔出现颅内出血。同时超声影像显示了早产兔脑出血的部位与人类早产儿GMH-IVH后的超声影像具有相同的特点，将早产兔安乐死，肉眼观察出血脑组织的大体标本也证实了超声所见。对GMH-IVH早产兔根据Derrick法[16]进行神经行为评分，发现GMH-IVH早产兔神经行为学上的改变亦符合早产儿GMH-IVH后的神经行为学改变。

通过对建立的GMH-IVH早产兔动物模型进一步实验研究，发现出血脑组织周围可见较多的嗜中性粒细胞和小胶质细胞围绕，可见细胞的凋亡及神经元的坏死及轴索的损伤[17]。β-淀粉样前体蛋白和神经微丝的免疫标记提示发生了轴突的损害。同时，通过对早产儿进行尸解也发现了同样的GMH-IVH后脑室周围细胞的凋亡及浸润[3]。由此可见此种动物模型不但具有很好的重复性，且与临床上GMH-IVH早产儿脑组织的病理生理变化较为一致，因此非常适合作为进一步研究早产儿GMH-IVH的理想动物模型，也将为进一步研究早产儿GMH-IVH后的继发性脑损伤机制，验证新的治疗方法奠定基础。

随着医疗水平的提高，越来越多的早产儿得以救治、存活。但是早产儿存活只是我们临床救治的初级目标，我们更需要做的是提高其生存质量。GMH-IVH作为早产儿常见的脑损伤形式之一，需要给予极大的关注。对于早产儿GMH-IVH的研究，基础研究的前提是动物模型的建立，只有建立了较为完善的动物模型，我们才能进一步从发病机制、治疗、预后等方面更加细致的研究早产儿GMH-IVH，为今后的治疗策略及治疗方法开辟进一步的研究方向。相信通过我们的不断努力，可以建立更为完善的早产动物GMH-IVH模型，从而进一步应用于临床，为人类带来更大的福音。

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医学论文中有关实验动物描述的要求

在医学论文的描述中，凡涉及到实验动物者，在描述中应符合以下要求：(1)品种、品系描述清楚；(2)强调来源交待；(3)遗传背景；(4)微生物学质量；(5)明确体质量；(6)明确等级；(7)明确饲养环境和实验环境；(8)明确性别；(9)有无质量合格证；(10)有对饲养的描述(如饲料类型、营养水平、照明方式、温度要求、湿度要求)；(11)所有动物数量准确；(12)详细描述动物的健康状况；(13)对动物实验的处理方式有单独清楚的交代；(14)全部有对照，部分可采用双因素方差分析。

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2013-07-18)