黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

冯 立,王 卓,杨 军,于 淼,王立强,邱广斌,翟如波,吴益民

斑点热(Spotted Fever, SF)是由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia, SFGR)引起，经蜱(少数由螨或蚤)传播的人兽共患自然疫源性疾病, 分布于世界各地。SFGR群内种类繁多，目前世界上巳发现近20种SFGR[1-2]。研究资料表明，由SFGR引起的斑点热病在我国很多地区广泛存在。我国巳分离到的SFGR有西伯利亚(Rickettsiasibirica)、黑龙江(Rickettsiaheilongjiangsis)立克次体，二者巳从蜱和病人分得[3-5]。

东北地区为我国最早发现的斑点热自然疫源地。为了解SFGR在当地媒介蜱的感染及SFGR种型，我们应用PCR方法对黑龙江逊克地区森林革蜱作了SFGR DNA检测。

1 材料与方法

1.1蜱标本采集 选择中俄边界黑龙江逊克地区不同生境采用人工布旗法采集蜱类，浸渍于70%酒精溶液中, 分类鉴定后进行DNA提取。

1.2蜱标本DNA提取 取出浸渍于70% 酒精溶液的森林革蜱用生理盐水洗涤3次, 滤纸吸干，于EP管内40 ℃过夜烘干。每只1组用玻璃研磨器研碎，应用上海生工生物公司“一管式基因组DNA抽提试剂盒”按说明书操作提取DNA, DNA模板置-20 ℃备用。

1.3PCR检测 采用SFGR外膜蛋白A基因(ompA)和立克次体柠檬酸合成酶基因(gltA)按文献[1.6]设计引物，由上海生工生物公司合成。引物序列和扩增条件见表1。

表1 PCR 扩增的目的基因及其引物序列

1.4核酸序列测定及聚类分析 PCR 阳性产物送上海申工生物技术公司测序。应用Internet网中BLAST操作平台，将测序所得结果与GenBank中注册的国际上常见的SFGR相应基因进行比较，采用DNAstar及Mega 5.0软件进行序列分析和聚类分析。

2 结 果

2.1SFGR 检测结果 对调查地区采集的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)60只(雄、雌各30只)，用SFGRompA引物70p/701n进行PCR检测。检出阳性14份, 阳性率为23.33%，其中雄性和雌性蜱标本检出阳性率分别为13.33%和10.00%。PCR电泳结果见图1.2。对ompA阳性蜱标本同时用gltA引物Rpcs877p/Rp1258n进行PCR扩增。随机选择2份ompA和gltA扩增阳性标本(XK-36, XK-40)作DNA测序。

2.2核苷酸序列比较 阳性标本XK-36和XK-40的ompA和gltA测序所得基因片段序列对比，二者的相似性均为100%。将XK-36ompA和gltA片段序列分别进行同源性比较和聚类分析。

XK-36ompA基因片段序列去掉两端引物，将其589 bp片段和GenBank中注册的主要SFGR的相应基因进行同源性比较，结果与Rikettsiasp.JL-02株关系最近，同源性达99.30%，两者仅有3个碱基差异；与Rikettsiaraoultii的同源性为99.18%，与Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica的同源性分别为92.90%和92.50%。

XK-36gltA基因片段序列去掉两端引物，将其331 bp片段和主要SFGR的相应基因进行同源性比较，结果与Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica同源性均为98.50%；与Rikettsiaheilongjiangsis和Rikettsiajaponica同源性均为98.20%。

图1ompA基因的PCR扩增

Fig.1PCRamplifiedompAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 3, 4, 6: PCR positive;

5: PCR negative.

图2gltA基因的PCR扩增

Fig.2PCRamplifiedgltAgenesintheticks

M: DNA maker (DL2000); 1: Positive control;

2: Negative control; 4, 6: PCR positive;

3, 5: PCR negative.

2.3核苷酸序列聚类分析 从图3ompA基因聚类分析可见，XK-36和Rikettsiasp.JL-02株分类一致和Rikettsiaraoultii株、蒙大拿立克次体与马赛立克次体同属一支。从图4gltA基因聚类分析可见，XK-36和Rikettsiaraoultii和Rikettsiasibirica比较接近，然并非同一支。

图3XK-36与SFGRompA核苷酸序列聚类分析

Fig.3PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36ompAgene

图4XK-36与SFGRgltA核苷酸序列聚类分析

Fig.4PhylogeneticanalysisofnucleotidesequencesofexanimatedXK-36gltAgene

3 讨 论

东北地区生态环境和气温条件适宜节肢动物和啮齿动物生长, 是我国最早发现的SFGR自然疫源地。该地区蜱类丰富，优势蜱种为森林革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、全沟硬蜱及长角血蜱，已从前三者分离到2种SFGR—R.sibirica和R.heilongjiangsis[3-5]。

本次调查证明，黑龙江逊克地区森林革蜱 SFGR 检出阳性率为23.33%，具有较高的带毒率, 雄性和雌性蜱检出阳性率无差异，说明该地区存在蜱传斑点疫源地。同源性比较与聚类分析结果表明, XK-36ompA基因序列与Rikettsiasp.JL-02同源性达99.30%，而与我国分离的R.heilongjiangsis、R.sibirica和R.mongolotimonae差异较大。gltA同源性分析显示, XK-36和R.raoultii和R.sibirica比较接近。

Rikettsia. sp. JL-02系从吉林长白山森林革蜱检测出(2003)，它和前苏联西伯利亚地区草原革蜱(D.nutallii)检出的新基因型Rikettsiasp.DnS14的ompA基因序列完全一致[7-9]。由于Rikettsiasp.DnS14首次检出于西伯利亚地区草原革蜱(1999)，Rikettsiasp.JL-02和XK-36分别从我国吉林省长白山地区和黑龙江流域逊克地区森林革蜱检测到，三者同属于东北亚地区，有着相似的地理环境和蜱种群分布，推测XK-36与Rikettsiasp.JL-02和Rikettsiasp.DnS14属于同一基因型。Roux[10]基于rrs基因序列比较,把Rikettsiasp.JL-02与R.heilongjiangsis和R.japonica归属于同一簇。以序列比较建立的聚类分析是来自某一基因片段，有时部分基因序列是无法代表整个基因序列。Fournier等人[11]提出了基于基因序列比较的立克次体新种定义标准，采用多个基因综合比较分析的方法。因此获得病原体，将有利于从病原学、流行病学及分子生物学作进一步研究。

分子生物学技术的发展与应用，促进了蜱媒传染病的自然疫源地调查研究水平, 通过以蜱为目标, 探索和发现已知或未知的病原体，及病原体、蜱与疾病的关糸。本次调查以PCR检测与序列分析，表明黑龙江流域逊克地区森林革蜱携带与Rikettsiasp.JL-02基因型一致的SFGR, 该地区存在斑点热疫源地。扩大调查范围，增加检测蜱样本数量、蜱种与测序样本数量，可为斑点热疫源地的证实提供更可靠依据。

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