食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

余倩，黄梦娜

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

余倩，黄梦娜

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

食品安全问题现在备受关注，食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生，传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐，耗时长，未能及时检验出食品中的致病菌，这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应（PCR）满足了快速检测致病菌的要求。主要介绍多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点，同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。

食源性致病菌；多重PCR；快速检测

近几年，食品安全问题的不断爆发，打击了消费者对食品安全的信心。我国各大品牌速冻食品被检出金黄色葡萄球菌超标；德国芽菜感染大肠杆菌致多人中毒；美国人生吃从墨西哥进口的西红柿，因含沙门氏菌而中毒；在我国山西干丰火腿肠的肉毒梭菌超标引起的中毒事件也引起社会的关注。各国因为致病菌污染食品引起中毒事件频频发生，为了避免类似食品安全事件的发生，食品中食源性致病菌的检测在当今社会中显得尤其重要。由于传统的微生物检测方法步骤繁琐，消耗时间长，工作量大，限制了该方法的广泛使用。分子生物学方法作为食品微生物学的主要检测方法之一，主要包括基因探针检测方法、PCR技术、基因芯片技术等[1]。近几年，聚合酶链式反应（PCR）技术凭借着特异性强、操作简便快速、灵敏度高、对标本的纯度要求低等优点迅速的发展起来。多重PCR技术是在原有PCR基础上加以改进，在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多条目的DNA的新型PCR技术，实现了多种食源性致病菌的同时检测。

1 多重PCR的原理及特点

1.1 原理

多重PCR原理与常规PCR基本相同。其基本原理是：在模板DNA、dNTP、适当缓冲溶液的混合体系中，加入多对特异性引物，在DNA聚合酶的催化作用下，根据碱基互补配对原则，对引物所界定的DNA样品中的不同序列进行扩增。多重PCR的过程包括变性、退火、延伸三个步骤组成，经过一个循环，形成新的DNA片段，该片段又可以作为下一轮反应的模板[2]。如此重复改变温度，有高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

1.2 特点

多重PCR保留了常规PCR特异性强、灵敏度高的特点，同时又减少了操作时间、操作步骤及试剂的用量[3]。特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，且可检测小片段缺失。多重PCR目前也存在着一定的不足：该检验方法不可区别活菌与死菌；引物之间可能存在干扰，因为反应条件对扩增结果有影响，所以要控制和协调好各反应条件。

2 多重PCR反应体系的组成

PCR反应体系主要由模板、引物、dNTP、缓冲液、Taq DNA聚合酶以及反应促进剂组成。PCR的模板的标本为核酸，主要为DNA。虽然大多数PCR对模板纯度要求不高，但仍然需要部分纯化，以除去标本中的Taq DNA聚合酶抑制物、蛋白酶、核酸酶等。引物是指与带扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，引物的合成与选择对PCR成功与否具有决定性意义[4]。反应中dNTP和MgCl2的浓度应该达到平衡，因为dNTP的结合和Taq DNA聚合酶发挥活性，都需要游离的镁离子。缓冲液的浓度提高到2×可以有效提高多重PCR的效率[5]。

3 多重PCR在食源性致病菌检测中的应用

随着食品安全问题的不断爆发，食品致病菌快速检测的要求越来越高。近几年，国内外的许多报道采用了多重PCR技术检测食源性致病菌，多重PCR快速检测各种食源性致病菌受到研究者的关注。

3.1 沙门氏菌（salmonella）的检测

据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的食物中毒名列榜首。传统的沙门氏菌检测是通过前增菌、选择性增菌、分离培养，并对该菌落分离物进行生化试验和血清实验来鉴定，所需时间至少为4 d～7 d。

陈诺等研究出用于检测沙门氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv、16S rRNA，血清群特异性引物基因rfb基因和血清型特异性引物基因fliC、fljB、via基因等[6]。针对沙门氏菌的靶基因，可通过设计合适的引物来进行多重PCR的检测。Geevaretham Jeyasekaran等通过五个不同的特异性引物基因fimA，、himA，、hns、invA和hto基因建立了多重PCR检测虾米中的沙门氏菌体系，该实验仅需8 h[7]。Camila等运用多重PCR技术，在巴西境内检测冷冻家禽肉中沙门氏菌污染及常见血清型的流行情况。该实验以沙门氏菌属特异性基因ompC、伤寒沙门氏菌ViaB基因、肠炎沙门氏菌7Sdf基因和鼠伤寒沙门氏菌Spy基因为靶基因，进行多重PCR特异性扩增实验，研究结果表明，阳性结果与常规微生物检测结果一致，且灵敏度高于常规微生物培养法[8]。而Ashok Kumar等研究发现了早期诊断伤寒副伤寒沙门氏菌的基因标志物，诊断采用多重PCR技术检测只需2 h，大大缩短了检测时间[9]。

3.2 肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli）的检测

肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株为O157∶H7。传统的大肠菌群检测是通过样品稀释后进行乳酸胆盐发酵实验，分离培养后进行革兰氏染色，采用显微镜观察鉴定。该方法操作步骤繁琐，耗时长，而且传统的生化试验鉴定和常规PCR都不能准确的监测和鉴定肠出血性大肠杆菌O157∶H7。

目前多重PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7时，主要的毒力基因有：编码志贺毒素stx1和stx2基因、编码与细菌粘附作用有关的蛋白eaeA基因、编码溶血素hly基因，因此这些基因被作为PCR检测的常用靶基因[10]。路长勇通过自主研发食源性致病菌特异性靶点的自动挖掘方法，建立优化了多重PCR的检测体系，包括单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的靶点筛选库，灵敏度较高[11]。Barbora Vidova等，从牛奶和肉类样品中，通过多重PCR反应体系，检测出肠出血性大肠杆菌O157∶H7[12]。多重PCR的运用对肠出血性大肠杆菌的检测提供了一个快速、有效的方法。

3.3 金黄色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）的检测

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染事件数量占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒的主要原因。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测主要有动物学实验、血清试验、免疫荧光试验及酶联免疫吸附等方法，多重PCR快速检测技术也是其中的一种。多重PCR的检测结果与免疫学检测结果基本一致，但多重PCR还可以检测一些免疫学方法不能检测的肠毒素基因。

目前用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素SE的相关靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因[6]。以及编码耐热核酸酶基因nuc，编码血浆凝固酶coa基因[13]。国外最早采用PCR方法是1991年Wilson等利用PCR技术从食品中检测出金黄色葡萄球菌，该方法8 h内即可检出人工污染的干燥脱脂奶中的金黄色葡萄球菌，检出量为105cfu/mL～106cfu/mL[14]。何晖等针对sea、seb、sec、sed、see 4个靶基因设计出四对引物进行PCR实验，达到了快速准确检测sea、seb、sec、sed、see 4个靶基因的目的，从而检测出金黄色葡萄球菌[15]。3.4 其他食源性致病菌的检测

多重PCR在其他食源性致病菌的检测中也得到了广泛的运用。肉毒梭菌一共有A、B、C、D、E、F和G七个型，其中引起食物中毒的主要是A、B、E、F四种型[16]。王颖群等通过对比各型肉毒神经毒素基因，选取其保守序列及16SrRNA基因的保守序列，设计了两对引物进行扩增，得出该引物可特异性扩增A、B、E、F和G型的梭菌[17]。王艳君等以沙门氏菌编码DNA结合蛋白hns基因、单核细胞增生李斯特氏菌溶血素Hly基因和大肠杆菌O157∶H7编码外膜蛋白紧密素eaeA基因为靶基因设计了3对引物，建立了利用多重PCR技术检测冷却肉制品中3种致病菌的方法[18]。多重PCR技术在志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等其他食源性致病菌的检测中也得到广泛运用。

4 小结

在经济发展的现代，人们追求更多的是健康，食品的安全成为社会关注的焦点。多重PCR快速检测技术特异性强和灵敏度高，操作简单，消耗时间和试剂少，一次反应可以检测多个基因型，减轻了工作量，同时还适用于小片段缺失的检验，这些优点使得多重PCR必将成为食源性致病菌的重要检验方法之一。同时多重PCR可以与其他技术相结合，如荧光定量PCR相结合，可提高检测效率。或是与其他检测方法相结合，如基因芯片、实时PCR等，可以创造一个更完整的体系。PCR技术现已用于肝炎、艾滋病、疱疹病毒感染诊断，在医学方面也作出了巨大贡献[5]。所以多重PCR技术除了在食品范围内得到应用，在科研和临床领域也将会得到更多更好的应用。

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Research of Multiplex PCR Fast Detection on Food-borne Bacterial Pathogens

YU Qian，HUANG Meng-na
（College of Food Science and Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

Food safety has already been become the focus of attention.Food poisoning incidents have occurred by the pollution of food-borne bacterial pathogens frequently.It is quite complex and cost much time of traditional methods for detection of food-borne pathogens，so it can't checkout the pathogenic bacteria in food timely.All of these disadvantages limit its application.Multiplex-PCR can meet the requirement of checking out the pathogenic bacteria fast.This article introduced the theory，characteristic，composition of detection system and application of Multiplex-PCR.Multiplex-PCR had the advantages of high specificity，high sensitivity，simple operation and checking multiple pathogenic bacteria at the same time.Furthermore，multiplex-PCR can combine with fluorescence quantitative PCR or gene chip technology to establish a better system.

food-borne bacterial pathogens；multiplex PCR；fast detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.034

2013-07-23

广东省科技计划项目（2011B031500023）

余倩（1979—），女（汉），副教授，研究生，研究方向：食品微生物。