生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的分离及耐药性分析

王 娟,黄秀梅，曲志娜，赵思俊，盖文燕，王玉东，王君玮

金黄色葡萄球菌在自然界中分布非常广泛，空气、水及人和动物的排泄物中都能分离到，因此食品受其污染的机会很多，是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。为了解我国目前生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况以及分离菌株的耐药情况，本文对山东、山西、湖南、重庆以及内蒙的部分奶牛场和挤奶站采样进行监测，为指导奶牛养殖场安全合理用药和保障消费者食品安全提供保障。

1 材料与方法

1.1质控菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国兽医药品监察所。

1.2主要试剂和培养基 7.5%NaCl肉汤、Baird-Parker琼脂、MH肉汤、生化反应管，均为北京陆桥技术有限公司生产；科玛嘉显色培养基郑州科玛嘉生物有限公司生产；冻干兔血浆广东环凯生物技术有限公司生产；Master Mix美国Promega公司生产；药敏板天津市金章科技发展有限公司生产；琼脂糖西班牙Biowest生产；Marker 2000 宝生物工程(大连)有限公司生产。

1.3主要仪器设备 恒温培养箱、可见分光光度计、基因扩增仪(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)等。

1.4样品采集 2013年春季分别从山东、山西、重庆、内蒙、湖南等5省(区、市)选择3个挤奶站或奶牛场采集样品，采集挤奶时前3把后的牛奶作为样品，每个点采集40份样品，共采集鲜奶样品600份。冷藏条件下，48 h内运送至实验室。

1.5金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

1.5.1细菌分离 取1 mL牛奶样品接种到10 mL7.5%NaCl肉汤中，于37 ℃温箱震荡培养20 h后，将增菌后的液体接种于Baird-Parker平板，36 ℃培养48 h，然后挑取可疑菌落接种到科玛嘉显色培养基上，划线接种到营养琼脂纯化培养后，待进一步细菌鉴定。

1.5.2形态鉴定 在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为浑浊带，最外层有一透明圈,在科玛嘉显色培养基上为粉色到红色圆形菌落。

1.5.3生化鉴定 挑取纯化好的单个菌落进行触酶试验和血浆凝固酶试验。触酶试验阳性的菌落再进行血浆凝固酶实验；血浆凝固酶实验中，呈现凝集者判为阳性，则该菌为金黄色葡萄球菌阳性。

1.5.4PCR鉴定 用DNASTAR 软件自行设计1 对引物，上游引物nuc上：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′，下游引物nuc下：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。扩增片段长度约为279 bp。煮沸法提取DNA，反应体系(25 μL)如下：上下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，Mix 12.5 μL ，加ddH2O补至25 μL。PCR循环条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，扩增36个循环；最后72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(含EB 0.5% μg/mL)，电泳结束后，在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果。

阳性菌株扩增产物送上海生物工程有限公司测序。

1.6耐药基因检测 参照参考文献[1]设计9 对引物，用PCR方法对分离鉴定金黄色葡萄球菌进行耐药基因检测。不同耐药基因扩增引物见表1。

表1 耐药基因扩增引物

1.7药物耐药性检测 按照CLSI 2008推荐的肉汤稀释法测定分离菌株对7类13种抗菌素的MIC值。7类13种抗菌药分别是：青霉素类(青霉素、氨苄西林、奥格门丁)；林可霉素类(克林霉素)；头孢类(头孢西丁、头孢噻呋)；大环内酯类(替米考星、红霉素)；万古霉素类(万古霉素)；磺胺类(磺胺异恶唑、新诺明)；喹诺酮类(恩诺沙星、氧氟沙星)。

2 结 果

2.1细菌分离鉴定结果 从采集的600份生牛奶中,检出金黄色葡萄球菌157株,检出率为26.17%；其中山东省分离率为12.50%，湖南省分离率为31.67%，山西省为33.33%，重庆市为18.33%，内蒙为35.0%。

以标准菌株ATCC29213为阳性对照，从牛奶样品中分离菌株能扩增出大小约为279 bp基因片段(图1),阳性对照样品均能扩增出预期大小的DNA基因片段。将分离菌株PCR产物测序结果表明，该基因片段长度为279 bp。序列结果与GenBank公布的序列同源性达99.5%以上，说明扩增的基因片段为金黄色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守区序列。

图1 金黄色葡萄球菌PCR扩增结果

2.2药敏检测结果 157株分离菌株除对恩诺沙星和万古霉素均敏感外，对其余11种抗菌药物均有不同程度的耐药，尤其对青霉素类中青霉素和氨苄西林的耐药率高达100%和98.73%；其次是对红霉素和克林霉素的耐药率分别为49.68%和43.95%；对奥格门丁、头孢噻呋、头孢西丁的耐药率分别为31.21%、28.03%、18.47%；对磺胺异恶唑和复方新诺明的耐药率分别为22.29%、5.73%；对氧氟沙星和替米考星的耐药率分别为4.46%、3.18%。

各省分离菌株对11种抗菌药物的耐药性有所不同，5省区分离菌株中，山西省分离菌株的耐药性最严重，如山西分离菌株对头孢噻呋、头孢西丁、奥格门丁、红霉素磺胺异恶唑的耐药率明显高于其他省区的分离菌30%～70%；其余4省区分离菌株对这些药物的耐药性差别不很明显，耐药率在20%以上的药物有4～5种。详见图2。

图2 5省区牛奶中金黄色葡萄球菌耐药性情况

分离菌株中，除1株耐1种药物外，其余菌株均为多重耐药，多重耐药率为99.36%；无8耐及以上菌株，主要集中在2耐(36.05%)、3耐(19.77%)、5耐(12.79%)和6耐(17.44%)，占分离菌株数的86.05%。

2.3耐药基因检测结果 检测结果表明，157株分离菌中，携带耐大环内酯类药物的msrA基因菌株最多，占分离菌株数的97.45%，有38.22%的分离菌株携带另一耐大环内酯类药物基因ermC；有70.06%的菌株携带耐β-内酰胺酶类药物基因,14.01%的分离菌株携带耐MRSA重要基因femA；同时携带耐喹诺酮类药物3种基因的分离菌株占94.99%；大多数分离菌株同时携带多种耐药基因。具体见表2。

图4 耐药因子PCR扩增结果

2.4分析 从检测结果看，生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染较严重，检出率为26.17%，与张彦春等的报道[2]一致。分离菌株耐药性较以往报道[2]有上升趋势，尤其是对青霉素类药物的耐药性非常严重，所有分离菌均耐青霉素，157株分离菌中，除2株菌外，其余菌株均对氨苄西林耐药，其次是对红霉素和克林霉素，耐药率在40%以上，这与相关实验室[3-6]的实验结果基本吻合；且分离菌株的多重耐药和交叉耐药严重,多重耐药率高达86.05%，与王登峰等人[5]的报道一致。另外，检测出有29株MRSA，其中有22株携带femA基因；通过检测发现，从耐药表型看，分离菌株对该类药的耐药性不严重，但是大多数菌株携带耐喹诺酮类药物基因，应引起重视。

表2 耐药基因检测结果

3 讨 论

从采集的600份生牛奶中,检出金黄色葡萄球菌157株,检出率为26.17% ，结果说明这些奶牛养殖场和挤奶站的生牛奶存在金黄色葡萄球菌的污染,其主要源于在挤奶过程中污染了牛奶。奶牛场要定期检查奶牛的乳房,并且奶挤出后,要迅速冷藏,细菌繁殖,以防毒素生成,奶制品要以消毒牛奶为原料,注意低温保存。食品中食源性致病菌的污染是引发食品安全问题的重要原因之一,因此，从源头上杜绝本菌对食品的污染,以降低金黄色葡萄球菌食物中毒的发生风险。

金黄色葡萄球菌对药物的适应性较强，自20世纪60年代发现MRSA以来，该菌的检出率呈上升趋势，本研究共检测到29株MRSA菌株，且所有MRSA菌株不仅对多种抗生素耐药，而且还携带多种耐药基因。耐甲氧西林和耐万古霉素金黄色葡萄球菌都是超级耐药菌[7]。污染耐药性金黄色葡萄球菌的动物性食品是导致人类感染的原因[8]。因此，为防止耐药性金黄色葡萄球菌引起的危害，有必要对其进行耐药性监测，保障人类健康。

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