霍山石斛 HPLC特征图谱研究

魏 刚, 顺庆生, 戴亚峰, 叶家宏, 李 滨, 黄月纯, 何祥林, 杨明志

（1.广州中医药大学, 广东 广州 510006； 2.上海健康职业技术学院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.广州中医药大学第一附属医院, 广东 广州 510405；5.安徽霍山长冲中药材开发有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中国中药协会石斛专业委员会, 云南 昆明 650031）

霍山石斛 HPLC特征图谱研究

魏 刚1, 顺庆生2, 戴亚峰3, 叶家宏1, 李 滨3, 黄月纯4*, 何祥林5, 杨明志6

（1.广州中医药大学, 广东 广州 510006； 2.上海健康职业技术学院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.广州中医药大学第一附属医院, 广东 广州 510405；5.安徽霍山长冲中药材开发有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中国中药协会石斛专业委员会, 云南 昆明 650031）

目的 建立霍山石斛 （ 霍山米斛） HPLC特征图谱分析方法， 拟定黄酮类成分指标群。 方法 采用 Kromasil 100-5 C18色谱柱; 流动相为 乙 腈-0.1% 磷 酸 溶液 （ 梯 度 洗脱） ; 检 测波 长 为 340 nm; 柱 温 为 35 ℃; 体 积 流 量 1.0 mL/min。 结果 霍山石斛标示出 24 个黄酮类特征共有峰， 10 批样品的相似度为 0.918 ～0.990， 相似度较高。 结论方法准确可靠，重复性好，本研究为霍山石斛的质量控制提供了方法依据。

霍山石斛;黄酮类成分;特征图谱;高效液相色谱法

霍山石斛是石斛中最名贵的品种，也是最具代表性的品种。 清代赵学敏 《本草纲目拾遗》［1］（公元 1765 年， 清乾隆30年） 书中明确、 详尽地阐释了霍石斛， 其中记载:“ 《百草镜》: 石斛近时有一种形短只寸许， 细如灯芯， 色青黄，咀之味甘，微有滑涎，系出六安州及颖州府霍山县，名霍山石斛，最佳。其功长于清胃热，惟胃肾有虚热者宜之，虚而无火者忌用。……范瑶初云:霍山属六安州。其地所产石斛名米心石斛，以形如累米，多节，类竹鞭，干之成团。 他产者不能米心， 多不成团也。” 因此霍山石斛又称霍山米斛。

霍山米斛野生资源由于遭到大规模的破坏，少见真影，直到本世纪八十年代， 才确定了其拉丁学名:Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng。 其中鉴定标本就是由安徽霍山县的何云峙先生所提供的。 2003 年包雪声、 顺庆生等出版 《霍山石斛》 一书， 两位作者收集、 栽种、 观察与鉴定的 （石斛） 种类至少涉及有 50 种; 同时认为:赵学敏、 赵学楷在 《本草纲目拾遗》 及 《百草镜》 中所记述的霍石斛或霍山石斛，其指的植物性状特征只能与霍山石斛 Dendrobium huoshanese C.Z.Tang et S.J.Cheng相互符合， 而不是指石斛属其他种类植物［2］。

霍山石斛局限分布于安徽省霍山县及邻近地区，以其味甘、黏质厚之上乘品质成为石斛中的极品，备受历代医家推崇［3］， 但目前尚未列入中国药典。 《 本草纲目拾遗》中有对霍山石斛产品加工及应用情况的明确记载。如 “彼土人以代茶茗” 的 “形曲不直” 的自然干燥产品， “有成毬 （球） 者……” 的人工卷曲加工产品， 而后者即为现代枫斗产品的前身［2］， 目前市场上的大量枫斗产品可能由此演变而来。由于霍山石斛独特的生长环境要求，以及历代的采挖和近代生态环境的改变，其野生资源日趋稀少，濒临灭绝［4］。 导致市场上充斥各种假冒伪劣 “霍石斛”、 “霍斗”、 “金霍斛”， 因此研究一种真伪鉴别的技术非常必要。

目前真正在市场上出售的霍山石斛成品极少，常用细茎石斛等加工冒充成霍山石斛［5-6］。 由于难以得到真正的米斛成品，有关米斛质量研究的报道更少。近年来霍山石斛人工栽培取得可喜进展，在安徽霍山县已经开始初步量产，本实验与霍山当地企业合作，采用人工栽培成功的米斛开展特征图谱的研究，有利于规范霍山石斛的市场。课题组前期已开展了铁皮石斛［7］、 齿瓣石斛［8］、 兜唇石斛［9］等特征指纹图谱的研究，本次在确保霍山石斛来源正品的基础上， 采用 HPLC特征图谱的分析技术来建立栽培霍山石斛特征图谱，为确保霍山石斛的质量提供依据，并初步比较了栽培品与野生品的差异。针对霍山地区常以铜皮石斛冒充霍山石斛的现状，初步比较了霍山米斛与霍山产铜皮石斛特征图谱差异。

1 仪器和试药

四元泵、 柱温箱、 二极管阵列检测器和 Agilent1200 色谱工作站 （ Agilent 1200 高效液相 色 谱仪， 美国 Agilent公司） ;Sartorius BP 211D 分析 天 平 （ 塞 多 利 斯天 平 有 限 公司）;KQ-400 KPE超声波清洗仪 （ 功率 500 W， 频率 40 kHz， 昆山市超声仪器有限公司）。 9 批栽培霍山石斛 （编号 S1 ～S9） 由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供， 1 批栽培霍山石斛 （编号 S10） 由何祥林提供， 1 批野生霍山石斛 （编号 S11） 及 1 批霍山栽培细茎石斛 （编号 S12） 由安徽九仙尊霍山石斛股份有限公司提供。霍山石斛经顺庆生教授鉴定系霍山石斛 Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的 茎， 细 茎 石 斛 为 Dendrobium moniliforme（L.） Sw.的茎， 当地俗称黄铜皮。 鲜品霍山石斛、 细茎石斛在60℃条件下减压烘干， 备用。 乙腈为色谱纯， 其他试剂为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5 C18色 谱 柱 （ 250 mm×4.6 mm， 5 μm）; 流动相由乙腈 （A） -0.1%磷酸溶液 （B）组成， 梯度洗脱 （0 ～30 min， 13% →18% 乙 腈;30 ～55 min， 18%→27%乙腈， 55 ～60 min， 27%→35%乙腈） ; 检测波长 340 nm; 柱温 35 ℃; 体积流量 1.0mL/min。

2.2 供试品溶液 取霍山石斛粉末 （过四号筛） 1 g， 精密称定， 加甲醇 50 mL， 回流提取 4 h， 取出， 放冷， 滤过，滤液减压蒸干，残渣加甲醇使之溶解， 置 2 m L量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，缓缓摇匀，即得。同法制备铜皮石斛的供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取 5 μL同一供试品溶液， 连续进样 6 次。 所得图谱与对照模式的相似度均大于 0.99，显示精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取 5 μL同一供试品溶液， 分别在 0、 3、 6、 9、 12、 24 h 进样。 所得图谱与对照模式的相似度均大于 0.99， 显示 24 h 内供试品溶液稳定性较好。

2.3.3 重复性试验 取 6 份同一批样品， 分别制备供试品溶液，进样分析。所得图谱与对照模式的相似度均大于0.99， 显示重复性良好。

2.4 样品检测 精密吸收 5 μL供试品溶液， 同法进样分析。

2.5 特征图谱的建立和分析

2.5.1 确定共有峰 根据以上 10 批霍山石斛的样品的分析结果， 其 HPLC色谱均有 24 个特征共有峰， 计算各特征共有峰的相对保留时间与相对峰面积，以峰5为参照峰（S） 计算， 结果见表 1。

表1 霍山石斛 HPLC特征图谱

2.5.2 相似度分析 采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 （2004A版） 进行， 以均值数法生成10批栽培霍山石斛特征图谱。 样品相似度比较结果见表2。 10 批样品 HPLC特征图谱重叠图及共有模式见图 1 ～2。野生霍山石斛 （见图 3） 除个别峰与栽培品不一致外， 绝大多数峰与栽培品一致，但相对峰面积比值有差异，与栽培霍山石斛特征图谱对照模式的相似度为 0.839。 铜皮石斛 （见图4） 主要为两个较大的特征峰， 与霍山石斛有明显差异。

表2 霍山石斛 HPLC特征图谱的相似度

图 1 10 批霍山石斛 HPLC的特征图谱重叠图

图2 霍山石斛 HPLC的特征图谱对照模式

图3 野生霍山石斛的 HPLC特征图谱

图4 霍山铜皮石斛 HPLC色谱图

3 讨论

石斛为名贵药材， 《中国药典》 2010 年版收载石斛为金钗石斛、 鼓槌石斛、 流苏石斛［10］， 并将铁皮石斛单列。霍山石斛是据考证石斛药用历史明确的四大石斛 （霍山石斛、铁皮石斛、细茎石斛、金钗花）之一，且是其中最具代表性的品种。 我们的系列研究表明可以采用 HPLC特征指纹图谱有效区分不同的石斛［7-9］。

本实 验 比 较 了 Kromasil 100-5 C18柱 （ 250 mm × 4.6mm， 5 μm）、 ZOBAX SB Aq 柱 （250 mm×4.6mm，5 μm）、 ZORBAX SB C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） 的分离效果， 其中以 Kromasil 100-5 C18柱的 分 离 度较好; 考察不同柱温 （25、 30、 35 和 40 ℃） 对分离效果的影响，结果以35℃效果最佳。 供试品溶液的制备比较了超声处理及回流提取方法，对部分特征峰回流提取效果较好，而且浓缩处理较方便，确定采用回流方法。

本研究分析了10批栽培霍山石斛样品， 各样品均具有24个共有峰， 平均总共有峰面积百分比大于总峰面积的90%; 以均值法生成的共有模式为对照， 10 批样品相似度大于 0.9， 表明栽培的霍山石斛具有比较稳定的 HPLC特征图谱，从而意味其质量稳定。研究还分析了1批野生霍山石斛，与栽培霍山石斛特征图谱对照模式为对照，相似度为 0.839， 主要特征峰基本一致， 提示栽培成功可行; 与栽培品相比，野生霍山石斛峰数较丰富，特征峰相对比值有差异， 野生品的峰 3、 峰 6 相对比值较大， 而峰 12、 峰17号则几乎未检出。

此外，实验初步比较了1批霍山产铜皮石斛，结果发现与霍山石斛有非常明显差异。课题组另对多批霍山产黄铜皮建立了特征图谱，确实与米斛特征明显不同。由于样品量较少，野生与栽培霍山石斛特征图谱规律性以及霍山石斛与铜皮石斛的差异性还有待进一步研究及证实。由于霍山石斛价格昂贵，暂无法大量制取获得对照品，霍山石斛黄酮类成分的鉴别有待进一步利用 LC-MS/MS 等技术对主要色谱峰进行成分归属等研究。

［1］ 赵学敏.本草纲目拾遗［M］.北京: 人民卫生出版社，1957:83.

［2］ 包雪声， 顺庆生， 周根余， 等.霍山石斛［M］.上海: 上海科学技术文献出版社， 2003:12-14.

［3］ 包雪声， 顺庆生， 陈立钻.中国药用石斛［M］.上海: 复旦大学出版社， 2001:75.

［4］ 刘守金， 武祖发，梁益敏， 等.霍山石斛的资源及生物学特牲［J］.中药材， 2001， 24（10）::709-710.

［5］ 陈存武， 戴 军，姚厚军， 等.霍山石斛资源与鉴定研究进展［J］.现代中药研究与实践， 2013， 27（3）:84-87.

［ 6 ］ 刘志超.霍山石斛发展现状与发展对策［J］.园艺与种苗，2012（10）:13-16

［ 7 ］ 魏 刚， 刘宏源， 黄月纯， 等.鲜铁皮石斛 HPLC特征图谱研究［J］.中成药， 2012， 34（9）:1739-1743.

［ 8 ］ 黄月纯， 杨丽娥， 魏 刚， 等.齿瓣石斛 HPLC特征图谱［ J］ .药物分析杂志， 2012， 32（11） :2071-2076.

［ 9 ］ 杨丽娥， 黄月纯， 魏 刚， 等.兜唇石斛 HPLC特征图谱研究［J］.中药新药与临床药理， 2012， 23（5）:299-302.

［10］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2010:85， 265.

:B

1001-1528（2014）12-2642-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.048

2014-06-03

魏 刚 （1969—）， 男， 研究员， 博士生导师， 研究方向: 中药新药研究与指纹图谱分析。 Tel: （020） 39358519， E-mail: weigang021@163.com

*通信作者: 黄月纯 （1968—）， 女， 主任中药师， 硕士生导师， 研究方向: 中药质量标准研究与指纹图谱分析。 Tel: （020）36591378， E-mail:huangyuechun@163.com