高迁移率族蛋白1与骨关节疾病的研究进展

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(昆明医科大学第二附属医院创伤外科，云南 昆明 650101)

高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一种普遍存在于哺乳动物真核细胞内的非组蛋白，最早被发现是在1973年，Goodwin等[1]利用羧甲基纤维素色谱法从小牛胸腺中分馏并进行氨基酸分析和分子量测定。但是首先有报告证明这种蛋白质在后期炎症反应中发挥着重要的功能却是在1999年，Wang等[2]利用小鼠建立的内毒素血症模型，从开始检测到肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)或白细胞介素1(interleukin1-1，IL-1)的8 h后，小鼠体内开始出现HMGB1。因其在炎症反应中出现的时间晚，持续时间长，故为晚期炎症反应提供了治疗靶标。在细胞内，HMGB1可连接DNA起修饰染色体和调节转录作用，在细胞外，HMGB1是一种促炎因子，可介导炎症反应、促进细胞分化等，具有普遍的生物学效应。近年来，不断有学者发现HMGB1与许多疾病的发生发展有着密切的关系，例如肿瘤、动脉粥样

硬化、风湿免疫性疾病，骨关节疾病等，本文重点介绍HMGB1在骨关节疾病中的研究进展。

1 HMGB1的分子结构

HMGB1是一种核DNA结合蛋白，由215个氨基酸组成，在进化上高度保守，他作为一种转录调控的辅助因子，在哺乳动物之间具有99%的同源性，人类HMGB1a蛋白与啮齿类动物的HMGB1仅在C末端重复序列中存在2个氨基酸的差异[3]。HMGB1蛋白由3个独立的结构域组成(A-box、B-box和C-box)。A-box介于第2到第79个氨基酸之间，是肝素结合位点，该区域的作用相当于是拮抗总HMGB1蛋白，重组A-box蛋白在科研研究中可以作为HMGB1的拮抗剂使用，他对HMGB1产生竞争性抑制的作用。B-box介于第89到第163个氨基酸之间，其所在的区域即是引起炎症反应的结构域，HMGB1的前炎症因子活性即存在于B-box的前20个氨基酸序列，他具有促炎活性和与晚期糖化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)结合的能力，A-box和B-box与DNA非特异性结合。C-box介于第186到第215个氨基酸之间，几乎完全由天冬氨酸和谷氨酸构成，故呈酸性，该区域的作用是在HMGB1核细胞迁移的过程中保护A-box和B-box[4]。需要特别提出的是，在23和45的位置上出现的2个半胱氨酸在低电势下氧化还原形成二硫键，可以激活1个beklinα自噬。在106位的半胱氨酸负责结合到TOLL样受体4(TOLL like reportor4，TLR-4)，并从活化的巨噬细胞释放细胞因子[5]。

2 HMGB1的释放

2.1 主动分泌

无论是炎性因子刺激还是细胞应激，均可刺激单核巨噬细胞、成熟的树突状细胞及自然杀伤细胞核等核池内的HMGB1乙酰化，促使他在细胞中重新分布，以保持胞浆和胞核的动态平衡[6]。但是HMGB1蛋白不具有前导肽序列，故不能通过内质网的经典途径分泌。他是由单核巨噬细胞通过专门的分泌性溶酶体产生囊泡，以出胞的方式分泌至细胞外 。

2.2 被动释放

除了主动分泌之外，当细胞发生损伤和死亡后可被动释放HMGB1[3]。凋亡细胞有着一定的特殊性：在细胞凋亡早期，因为HMGB1与胞核DNA紧密结合在一起，故不能释放至细胞外。但在细胞凋亡的晚期，HMGB1可与DNA和细胞残体分开，从而释放到细胞外促进炎症发生，且HMGB1的被动释放可能与凋亡细胞的类型相关[7]。同时，当凋亡细胞被巨噬细胞吞噬之后，也可刺激巨噬细胞主动分泌HMGB1。

2.3 其他方式

某些细胞还可通过自分泌的形式分泌HMGB1，但是只对该细胞周围的组织器官起作用，不参与全身炎症反应

3 HMGBl的受体

HMGB1经过一系列的翻译后修饰，如乙酰化，磷酸化，甲基化和多聚核糖基化等，最终释放到细胞外激活免疫和炎症反应，其中包括RAGE、TLR、多配体蛋白聚糖、络氨酸磷酸酶、血栓素等受体，目前研究较多的是RAGE和TLR。

3.1 RAGE

RAGE是一种免疫球蛋白，位于细胞表面，和HMGB1结合可促进肿瘤生长，参与炎症反应。他是由一个N端序列、一个V形区域和两个C型区域组成。V形区域和C1区域连接在一起形成一个结构单元，该结构单元在识别配体上起重要作用。RAGE有一个跨膜域和一个胞质域，该区域对信号传导至关重要[8]。HMGB1的生物学功能是通过其B-box与RAGE的V形结构域相结合实现的。HMGB1与RAGE的结合还取决于肝素、细胞表面蛋白聚糖等多种因素。有研究表明[9]，和HMGB1相比，RAGE更容易与肝素形成复合物，且更稳定，这为肝素拮抗HMGB1提供了新的依据。另外，HMGB1-RAGE的相互作用可能与炎性骨质流失和骨重建有关[10]。最近有研究人员开发了一种新型蛋白质骨架为基础的HMGB1抑制剂，在体外能抑制HMGB1-RAGE的相互作用，且呈剂量依赖性[11]。

3.2 TLR

TLR是一组横跨膜的蛋白质(TLR1到TLR10)，和HMGB1结合可以刺激固有免疫，诱导新生血管。他们是由胞外域、跨膜域和胞质域组成。胞外域是一组富含亮氨酸的重复序列，用来调节配体的识别,而胞质域包含TOLL/IL-1受体，对信号传导起着关键作用[12]。目前报道的与HMGB1有关的TLR包括TLR2，TLR4和TLR9，但很少有HMGB1与这些受体之间结合机制的研究，肝素可能在介导的HMGB1-RAGE相互作用中起重要作用，但不知道他是否介导HMGB1-TLR的相互作用[9],还需要进一步的研究来探讨HMGB1-TLR结合的机制。

4 HMGB1与骨关节疾病的关系

4.1 类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其特征为慢性滑膜炎症和关节软骨侵蚀,该疾病全世界患病率是0.51%。滑膜细胞、巨噬细胞和单核细胞生产的促炎细胞因子(如TNF-α，IL-1和IL-6)和金属蛋白酶在RA患者关节骨与软骨破坏中发挥重要作用。HMGB1也已被证明了在发病中是重要的促炎因子，在大多数RA患者的血清中，HMGB1的水平比健康对照组显著高，并且与疾病活动的程度相关。Kokkola等[13]首次发现在RA患者及佐剂性关节炎实验大鼠滑膜组织中，无论是细胞核，细胞质，还是在细胞外，HMGB1均高度表达。Taniguchi等[14]发现RA患者的血清，关节液和滑膜组织中HMGB1水平均高于健康人。Ostberg等[15]将重组的HMGB1纯化蛋白注入DNaseII(-/-)×IFNRI(-/-)小鼠关节腔内，建立了一个很好的类风湿性关节炎模型，进一步证明了HMGB1在RA发病机制中的作用。在RA关节滑膜细胞中，HMGB1主要表达在滑膜上皮细胞，以巨噬细胞样滑膜细胞的细胞质和细胞外基质为主，而滑膜下细胞基本上无HMGB1的表达[16]。血管翳是巨噬细胞、破骨细胞等侵入的滑膜组织，逐渐侵蚀软骨、软骨下骨和骨骼，在RA患者的血管翳内，有高表达的HMGB1、IL-1和TNF-α等促炎因子，提示HMGB1可能参与软骨破坏的病理过程。在RA患者的关节中，破骨细胞是软骨和支撑结构被破坏的关键因素，破骨细胞和成骨细胞均可释放HMGB1，成骨细胞主要是受甲状旁腺素的刺激释放，并且可能会介导骨重建。同时HMGB1也是一种破骨细胞激活剂，对软骨及软骨下骨有直接的破坏作用[10]。骨髓内，骨凋亡细胞也可释放HMGB1，作为骨吸收信号导致炎性骨质流失。HMGB1还可以加速的组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,t-PA)催化纤溶酶原和金属蛋白酶的活动，在关节炎的早期即可通过该过程引起软骨和骨的破坏。

4.2 强直性脊柱炎

强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一种慢性风湿性疾病，其特点是骶髂关节疼痛，脊柱关节附着部位局部炎症、骨化，最终导致患者残疾和功能受限[17]。对于该疾病的病因和发病机制尚未完全了解。虽然尚未找到微生物与AS发病机制的直接联系，但是目前已经证实微生物可能通过泌尿系统或消化系统刺激TLR引发慢性炎症，而坏死细胞释放的HMGB1可通过RAGE和TLR介导，从而参与AS的发病过程。近年来，国内外学者对AS患者血清HMGB1的表达做了一系列研究，李宏芬等[18]分别对40例AS患者和健康对照组的血清HMGB1进行了对比，他们认为AS患者血清中HMGB1的水平高于健康对照者，且与AS活动期指标C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),血小板(blood platelet，PLT)均呈正相关。刘小军等[19]认为，AS患者血清HMGB1的水平与ESR、强直性脊柱炎常用疗效评分标准(Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index，BASDAI)呈正相关，而与CRP无关。但最近，Oktayoglu等[20]发表了一项研究，他们利用30名AS患者和29名健康对照组，检测其血清HMGB1含量和各项AS指标，包括强直性脊柱炎功能性指数(Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index，BASFI)、BASDAI、ESR、CRP、PLT等，发现在AS患者的血清HMGB1水平高于健康对照组，但是与其他AS的指标均不相关，最后他们建议尽管在AS的发病机制中HMGB1可能发挥重要作用，但并不是一个反应疾病活动的好指标。对于HMGB1在AS发病机制中的作用还需进行大样本的进一步的研究。

4.3 骨肉瘤

骨肉瘤是一种常发生在20岁以下的青少年或儿童的恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，约占小儿肿瘤的5%。在骨肉瘤的化疗过程中，常会有化疗药物耐药的情况出现[21]。有研究发现，阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤都能促进人骨肉瘤细胞HMGB1表达增强，而HMGB1介导的细胞自噬[22](程序性细胞存活机制，与细胞凋亡相对)将显著提高化疗药物的耐药性。采用短发夹核糖核酸(short hairpin Ribonucleic Acid,shRNA)介导的方式敲出HMGB1后，无论是在体内还是体外均可促进骨肉瘤细胞死亡和抑制其生长。因此，降低HMGB1的表达可抑制骨肉瘤细胞自噬，增加骨肉瘤细胞的死亡和化疗药物的敏感性[23]。另外，维持HMGB1 A-box的氧化还原状态，可能会调节顺铂的抗肿瘤活性[24]。总之，对于HMGB1的研究将作为骨肉瘤治疗的一个新的目标。

4.4 骨关节炎

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变、骨赘形成、软骨下骨化为特点的慢性炎性关节炎，还可以诱发继发性滑膜炎，其发病机制仍未完全明了。以前有学者认为，在OA的发病中，HMGB1的表达和炎性细胞因子IL-6、IL-8一样会上调[25]。最近，Heinola等[26]已经证实，在牛膝关节骨性关节炎中，HMGB1通过基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)来介导组织蛋白的降解和重塑。Kyostio等[27]利用STR/ORT小鼠制造了一个很好的自发性骨关节炎的模型，该模型骨关节炎增生的滑膜组织中。HMGB1相对于对照组明显升高。Terada等[28]利用PT-PCR和免疫组化对27例OA患者关节软骨和4例正常关节软骨进行分析，发现在OA患者关节软骨中，无论是mRNA还是HMGB1的表达均远大于正常关节软骨，且HMGB1在细胞内的表达主要是在细胞质内，在细胞核内OA患者和对照组无明显区别，故可推测在OA的发病机制中核外HMGB1可能起重要作用。

5 HMGB1拮抗剂

HMGB1的拮抗剂包括特异性HMGB1中和抗体，丙酮酸乙酯，HMGB1 A-box蛋白，硬脂酰溶血磷脂酰胆碱，他汀类药物等。丙酮酸乙酯是一种氧自由基清道夫，也是目前研究较多的一种HMGB1拮抗剂。他可能的机制是抑制核因子kB(NF-kB)和酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK)/信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信号通路，以及其抗氧化的作用。他可以抑制多种炎症介质的释放，显著降低血清HMGB1的水平[29]。Yang J等[30]利用单克隆抗HMGB1抗体和HMGB1 A-box蛋白，在胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)动物模型上成功的改善了其关节炎的症状。Otoshi等[31]也在动物实验上证实了HMGB1阻断治疗对于髓核移植引起的神经根性痛有一定的效果，但抗HMGB1抗体和A-box蛋白制备困难，且价格比较昂贵，离临床应用还有一定的距离。有报道称[32]RA患者血清HMGB1水平与胆碱能抗炎途径的活性有关，在CIA实验动物模型中，通过增强迷走神经的信号传导，可以明显减少HMGB1的释放和抑制HMGB1的促炎活性，因此将来可以通过增加迷走神经的活动来减低HMGB1的水平。近年来，也有学者研究中草药制剂对HMGB1的抑制作用，如甘草酸等，特别是在抗肿瘤方面[33]。

6 小结与展望

HMGB1作为一种核因子和一种分泌蛋白，他是动植物生存所必须的蛋白，他在细胞内可以起到修饰染色质和调节转录的作用。在细胞外，它与RAGE，TLR等受体以高亲和力结合，在炎症晚期诱导促炎因子活化，介导炎症反应。也正是由于他出现在炎症晚期这一特点，为临床上的治疗提供了明确的治疗靶标和足够的治疗时间。但对于HMGB1的作用机制还需进一步的研究，如HMGB1-TLR相互作用的机制，HMGB1在AS发病过程中的作用等。这些问题的阐明将有助于为这些疾病提供新的治疗策略

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