阿霉素肾病动物模型的研究进展

郭继光，白杨，周广滨

（1.河北大学医学部微生物学教研室，河北保定071002；2.河北大学公共外语教研部，河北保定071002；3.高碑店市医院神经外科，河北高碑店074000）

阿霉素肾病动物模型的研究进展

郭继光1，白杨2，周广滨3

（1.河北大学医学部微生物学教研室，河北保定071002；2.河北大学公共外语教研部，河北保定071002；3.高碑店市医院神经外科，河北高碑店074000）

阿霉素；动物模型；局灶节段性肾小球硬化症；慢性肾病

大多数慢性肾病的特征是出现肾小球硬化症、肾小管间质炎症和纤维化。阿霉素是一种经典的啮齿类肾炎损伤诱发剂，能够引发初期局灶节段性肾小球硬化症，可很好地模拟人体的慢性肾炎状况。1970年Sternberg首次报道蒽环类抗生素能够引起肾炎［1］。阿霉素诱导的大鼠肾炎模型在1976年首次被报道［2］，之后小鼠的阿霉素肾炎模型在1998年被报道［3］。1977年，Burke等［4］报道了1例78岁老人在使用阿霉素后产生了肾功能衰竭症状。从此，阿霉素肾炎大鼠模型就引起了学者们广泛和深入的研究，以进一步揭示肾脏损伤的病理机制。

1 阿霉素肾炎动物模型的优缺点

阿霉素肾炎作为一种肾炎实验模型有许多优点。该模型的典型特征是用药几天之内就发生肾脏的严重损伤，机体体质量减轻，但损伤发生的时段很稳定，而且可以预料，因此死亡率较低（5%）［5］。这种损伤的状况和发生时间的可预见性，使其成为检测肾脏损伤恶化或者减轻的合适模型。该模型损伤的结构和功能与人类慢性蛋白尿肾病的状况非常近似。此外，该模型在大鼠和小鼠中的情况也相似［6］。目前有许多病理学研究都使用了阿霉素诱导的肾炎动物模型［7－8］，表明啮齿类模型对科学研究是十分便利的。

但该模型的应用也存在一些不足。不同批次的阿霉素的效果存在波动。在使用中常常会碰到某些批次的阿霉素肾脏损伤效果低下导致造模失败的情况。所以通常购买到新的批次阿霉素时，最好先测试一下药效再大量使用。由于模型的制作要求操作人员具备一定的技术，对初学者具有一定的难度。一般来说，多数采用大鼠尾静脉注射药物，需要注意掌握一些技巧，比如，注射过程中可以使用白炽灯温暖尾巴以维持血管的舒张状态。另外，未经麻醉的大鼠尾静脉注射效果更明显，但大鼠的挣扎增加了操作难度，因此需要两名操作者配合完成注射。阿霉素的治疗浓度范围较窄，使用的剂量偏大或者偏小0.5mg／kg，就能导致动物死亡或者肾脏损伤不足。即使模型制作使用稳定的批次、操作妥当且用药剂量精确，还有最后一道关卡就是个体差异。有时候，同一批同品种的大鼠之间也存在较大的个体差异，甚至导致造模失败。实验动物的不同种系对阿霉素的敏感性存在差异，也使得该模型的应用受到限制。尽管存在上述问题，该模型用于慢性肾病的研究仍具备很多便利因素，并有助于进一步揭示慢性肾病的发病机制和治疗方法。

2 阿霉素肾炎动物模型的药代动力学机制

阿霉素是一种蒽环类抗生素，同时也是使用广泛的人类抗肿瘤药物。道诺霉素和阿霉素是最早出现的两种蒽环类抗生素，在20世纪60年代即投入生产。人们已经详尽地研究了它们在人类和动物体内的药物代谢动力学，并发现它们存在一些差异。阿霉素进入机体后，血浆清除快并且有显著的组织结合，主要由肝脏进行代谢。人体通过尿液5 d能排出4%～5%的阿霉素，通过胆汁7 d内排出给药量的40%～50%［9］。大鼠和小鼠接受静脉给药后，阿霉素会从血浆中快速清除，在组织中沉积，并能够经过尿液和胆汁缓慢排泄。阿霉素代谢缓慢，主要累积在肾脏，部分见于肝脏、心脏和小肠［10］。这可能是阿霉素比道诺霉素具有更强的肾脏毒性和更广泛的治疗指数的原因。

3 阿霉素肾炎动物模型的给药方式

3.1 动物品系

一般根据大小鼠具体的种系、雌雄、年龄、来源和批次，选择阿霉素最佳给药方式。多数品种的大鼠对阿霉素肾脏损伤十分敏感。雄性Wistar大鼠的阿霉素有效剂量范围在1.5～7.5 mg／kg［11］。BALB／c小鼠需要9.8～10.4 mg／kg，而雄性BALB／c SCID小鼠（一种淋巴细胞被敲除的BALB／c近交系小鼠）仅需要5.3 mg／kg［12］。C57BL／c小鼠对阿霉素导致的肾脏损伤具有高度的抗性，但高剂量（13～25 mg／kg）能够诱导肾损伤［13－15］。

3.2 给药方式和途径

在多数的研究中都是进行单次注射，但是也存在其他的多种给药方式（20 d内每2天注射2 mg／kg，7 d内每天注射1 mg／kg，14 d内每隔6 d注射2.5 mg／kg）。静脉注射是最常用的给药途径，包括尾静脉、阴茎静脉［16］、股静脉［17］和臀静脉［18］，但以尾静脉最常见。尾静脉注射的主要问题是组织液外渗导致的表皮坏死。阿霉素的治疗剂量范围十分狭窄，因此操作上的微小计量的偏差就能够导致相当的药效差异。另外一个给药途径是胸部心脏直接注射，如雄性的Wistar大鼠可注射7 mg／kg［19］，但是需要事先进行麻醉。肾脏直接注射阿霉素结合对侧肾脏切除手术，可以在4周内诱发肾脏损伤。直接通过肾脏动脉给药的方式只在研究药物动力学时对狗实施过［20］。尽管有关这些方法有报道说比较安全，但是心脏和肾脏直接给药的方式会产生较大的损伤，因而限制了它们的广泛使用。大多数研究在选用小鼠造模时，多选择便捷的腹腔给药途径［21］，但是由于腹膜吸收的差异性，导致该方法不如静脉注射的效果稳定。

3.3 影响因素

阿霉素运送到靶器官的过程可能会受到多种因素的影响。暂时性的切断一侧肾动脉，能够保护静脉注射阿霉素时对该侧肾脏的损伤［22］。另外，NO对血流的抑制能够阻止肾小球肾炎的发生。这些研究也证明了阿霉素对于肾脏的损伤是通过与肾脏直接作用而诱发的［23］。雄性大鼠比雌性大鼠对阿霉素诱导的肾病更加敏感。阉割的雄性大鼠比起假手术的雄性大鼠对阿霉素的易感性降低［24］。由于肾脏损伤的严重程度存在差异，在考虑用阿霉素肾病作为肾脏损伤模型进行实验设计时，雌雄的选择也是一个重要因素。

4 阿霉素肾炎动物模型主要特征

阿霉素肾病动物模型中的组织改变与人类局灶节段性肾小球硬化症相类似，包括足细胞损伤以及随后发生的肾小球硬化症、肾小管间质炎症和纤维化［25］。阿霉素导致的肾小球上皮变薄和足细胞的消失会降低肾脏对血浆蛋白质的滤过功能［13］。这些变化在阿霉素注射后1～2周就能观察到，在第4周时相当明显。肾功能的变化和慢性肾病特征相一致，包括血液肌酐含量增加、肌酐清除率下降、清蛋白减少、脂代谢紊乱、蛋白尿。进一步的组织化学检查表明，损伤后的肾脏出现严重的肾间质炎症，并可见大量的T细胞、B细胞和巨噬细胞浸润［25］。在阿霉素损伤后的肾皮质和髓质中，CD4＋和CD8＋细胞数目明显增加。这种T细胞的增多仅在肾脏中出现，而在脾脏中未出现，说明这些细胞在调节肾脏损伤的过程中起直接作用。

4.1 基因易感性

阿霉素肾病的易感性是品系特异的，例如，BALB／c小鼠对阿霉素高度敏感，而C57BL／6小鼠则具有高度耐受性［11］。通过繁育实验已经发现了一个和阿霉素肾病易感性有关的基因座，位于16号染色体，属于隐性遗传。与易感性有关的基因座的等位基因与8号染色体上的蛋白精氨酸甲基化转移酶（protein arginine methyltransferase）的表达抑制有关，而该蛋白又与化疗试剂的细胞敏感性有关［26］。此外，遗传背景的不同对阿霉素肾病的发病程度有明显影响。研究表明8号染色体上的一个基因座与肾病发展程度和严重性相关［26］。

最近的研究表明，机体对阿霉素的易感性与免疫系统的差异有关。例如，BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠的Th1／Th2模式存在差异，C57BL／6小鼠的免疫反应更倾向于Th1类型，而BALB／c小鼠则与之相反。因此C57BL／6的免疫系统对细胞内感染的准备更足，从而获得了更强的抵抗性。有研究对不同品系的小鼠与阿霉素肾病的易感性进行了总结［27］，其中易感的小鼠品系包括BALB／Cj、129sVj、129s1／sViMj和BALB／CbYj，有抗性的品系包括C57BL6／J、FVB／NJ、CAST／EiJ、AKR／J、C3H／HeJ、CBA／J、C57BL／10J、LP／J、SWR／J、SJL／J和129S6／SvEvTac。

4.2 发病机制

阿霉素通过对肾小球的直接毒性损伤以及随后的肾小管间质损伤诱发肾病。阿霉素对肾小球滤过屏障各个组成部分（肾小球内皮细胞、基底膜和足细胞）均可造成影响。阿霉素还能导致多糖包被厚度减小、肾小球血管内皮细胞的孔隙增大、肾小球电荷选择性减少以及足细胞的足突融合。肾小球内皮细胞产生的蛋白多糖包被是由蛋白聚糖和黏多糖组成，其减少与上述的肾小球滤过屏障的改变相关［13］。研究表明阻断肾动脉能够使肾脏免受阿霉素的损伤，证明阿霉素肾病的产生是阿霉素直接作用于肾脏所致［22］。

进一步的研究已经深入到阿霉素诱导的肾脏损伤的分子机制中，自由基的增多已被提出作为其中的一个发病机制。通过隔离灌注研究八目鳗（Myxine glutinosa）肾小球的结果支持了这一观点；在此研究中发现阿霉素能够降低肾小球ATP酶活性，从而引起透水性的下降，这一作用可以被巯基供体N-乙酰半胱氨酸（sulfhydryl donor N-acetylcysteine）逆转［28］。此外，阿霉素会导致肝脏、肾脏和心脏中的谷胱甘肽（一种抗氧化剂）耗竭，而脂类过氧化物水平升高［29］。

晚期糖基化终末产物也参与了阿霉素的发病机制。研究发现阿霉素不会导致RAGE敲除小鼠的足细胞损伤和蛋白尿。进一步的研究表明，阿霉素会诱导产生RAGE配体，而RAGE配体参与了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸化酶和p44／p42 MAP激酶信号的激活，并引起促纤维化生长因子的上调［30］。

［1］ Sternberg SS.Cross-striated fibrils and other ultrastructural alterations in glomeruliof ratswith daunomycin nephrosis［J］.Lab Invest，1970，23（1）：39－51.

［2］ Bucciarelli E，Binazzi R，Santori P，et al.Nephrotic syndrome in rats due to adriamycin chlorhydrate［J］.Lav Ist Anat Istol Patol Univ Studi Perugia，1976，36（2）：53－69

［3］ Chen A，Sheu LF，Ho YS，et al.Experimental focal segmental glomerulosclerosis in mice［J］.Nephron，1998，78（4）：440－452.

［4］ Burke JJ，Laucius JF，Brodovsky HS，et al.Doxorubicin hydrochloride-associated renal failure［J］.Arch Intern Med，1977，137（3）：385－388.

［5］ Pippin JW，Brinkkoetter PT，Cormack-Aboud FC，et al.Inducible rodentmodels of acquired podocyte diseases［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2009，296（2）：F213－F229.

［6］ Weiss RB.The anthracyclines：will we ever find a better doxorubicin［J］？Semin Oncol，1992，19（6）：670－686.

［7］ De Mik SM，Hoogduijn MJ，de Bruin RW，et al.Pathophysiology and treatmentof focal segmental glomerulosclerosis：the role of animalmodels［J］.BMC Nephrol，2013，14：74.

［8］ Takiue K，Sugiyama H，Inoue T，et al.Acatalasemic mice are mildly susceptible to adriamycin nephropathy and exhibit increased albuminuria and glomerulosclerosis［J］.BMCNephrol，2012，13：14.

［9］ Takanashi S，Bachur NR.Adriamycin metabolism in man.Evidence from urinary metabolites［J］.Drug Metab Dispos，1976，4（1）：79－87.

［10］ Yesair DW，Schwartzbach E，Shuck D，etal.Comparative pharmacokinetics of daunomycin and adriamycin in several animal species［J］.Cancer Res，1972，32（6）：1177－1183.

［11］ Cao Q，Wang Y，Zheng D，et al.IL-10／TGF-betamodified macrophages induce regulatory T cells and protect against adriamycin nephrosis［J］.JAm Soc Nephrol，2010，21（6）：933－942.

［12］ Lee VW，Wang Y，Qin X，et al.Adriamycin nephropathy in severe combined immunodeficient（SCID）mice［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21（11）：3293－3298.

［13］ Jeansson M，Bjorck K，Tenstad O，et al.Adriamycin alters glomerular endothelium to induce proteinuria［J］.JAm Soc Nephrol，2009，20（1）：114－122.

［14］ Hayashi K，Sasamura H，Ishiguro K，et al.Regression of glomerulosclerosis in response to transient treatment with angiotensinⅡblockers is attenuated by blockade of matrix metalloproteinase-2［J］.Kidney Int，2010，78（1）：69－78.

［15］ HeikkiläE，Juhila J，Lassila M，etal.β-Cateninmediates adriamycin-induced albuminuria and podocyte injury in the adult mouse kidneys［J］.Nephrol Dial Transplant，2010，25（8）：2437－2446.

［16］ Deelman LE，Navis G，de Boer E，et al.Role of proteinuria in the regulation of renal renin-angiotensin system components in unilateral proteinuric rats［J］.JRenin Angiotensin Aldosterone Syst，2003，4（1）：38－42.

［17］ Mandelbaum A，Podjarny E，Bernheim J，et al.Role of thromboxane in the altered vascular reactivity of pregnant rats with adriamycin nephropathy［J］.Nephrol Dial Transplant，1999，14（5）：1124－1128.

［18］ Cheng H，Fan X，Guan Y，etal.Distinct roles for basal and induced COX-2 in podocyte injury［J］.JAm Soc Nephrol，2009，20（9）：1953－1962.

［19］ Rangan GK，Wang Y，Harris DC.Induction of proteinuric chronic glomerular disease in the rat（Rattus norvegicus）by intracardiac injection of doxorubicin hydrochloride［J］.Contemp Top Lab Anim Sci，2001，40（5）：44－49.

［20］ Porpaczy P，Schmidbauer CP，Georgopoulos A，et al.Concentrations of doxorubicin in renal interstitial fluid after peripheral intravenous and intrarenal artery infusion in dogs［J］.JUrol，1984，131（1）：169－172.

［21］ Johansen PB.Doxorubicin pharmacokinetics after intravenous and intraperitoneal administration in the nude mouse［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1981，5（4）：267－270.

［22］ De Boer E，Navis G，Tiebosch AT，et al.Systemic factors are involved in the pathogenesis of proteinuria-induced glomerulosclerosis in adriamycin nephrotic rats［J］.JAm Soc Nephrol，1999，10（11）：2359－2366.

［23］ Ochodnicky P，Henning RH，Buikema H，et al.Renal endothelial function and blood flow predict the individual susceptibility to adriamycin-induced renal damage［J］.Nephrol Dial Transplant，2009，24（2）：413－420.

［24］ Sakemi T，Ohtsuka N，Tomiyoshi Y，et al.Sex difference in progression of adriamycin-induced nephropathy in rats［J］.Am JNephrol，1996，16（6）：540－547.

［25］ Wang Y，Wang YP，Tay YC，et al.Progressive adriamycin nephropathy in mice：sequence of histologic and immunohistochemical events［J］.Kidney Int，2000，58（4）：1797－1804.

［26］ Zheng Z，Schmidt-Ott KM，Chua S，etal.A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（7）：2502－2507.

［27］ Zheng Z.An ancestralhaplotype defines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the laboratory mouse［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（7）：1796－1800.

［28］ Kastner S，Fels LM，Koob-Emunds L，et al.Effects of adriamycin on the balance of glomerular protein metabolism：studies in isolated glomeruli of the atlantic hagfish，myxine glutinosa［J］.Cell Physiol Biochem，1995，5（6）：399－407

［29］ Barbey MM，Fels LM，Soose M，et al.Adriamycin affects glomerular renal function：evidence for the involvement of oxygen radicals［J］.Free Radic Res Commun，1989，7（3／6）：195－203.

［30］ Guo J，Ananthakrishnan R，Qu W，et al.RAGEmediates podocyte injury in adriamycin-induced glomerulosclerosis［J］.JAm Soc Nephrol，2008，19（5）：961－972.

R965.1

B

1671－7783（2014）02－0181－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130255

保定市科学研究与发展计划资助项目（11ZF009）

2013－11－06 ［编辑］陈海林