生物杀虫剂球形赖氨酸芽孢杆菌的研究进展*

付蒙颖 王 英 钟 敏 艾国平

(第三军医大学军事预防医学院热带医学研究所，重庆 400038)

在过去的一个世纪里，人类成功从昆虫体内分离到了多种细菌，迄今为止研究最为广泛的是苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis。这些细菌已经证实非常有效，目前市面上有超过100种产品用于控制各种农作物害虫和能够传播人类疾病的虫媒。在过去的十年中，另一个杀虫细菌，球型芽孢杆菌(Bacillussphaericus，Bs)逐渐受到关注并产生了商业化的产品，Bs的许多亚种被证实具有杀灭蚊幼虫的能力。Kellen等(1965)首次报道了Bs是一种昆虫病原体，尽管这一报道提示了Bs的重要性，但是直到1973年才认识到Bs可以作为一种杀灭昆虫的生物杀虫剂(Singer, 1973)。从此开始，我们对Bs的研究才有了进一步的发展，包括它的毒性机制和对宿主的毒性研究。本文将对Bs，目前更名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus,L.sphaericus)的特性、灭蚊毒素及作用机制进行综述。

1 杀虫活性

自从1965年发现球形赖氨酸芽孢杆菌具有昆虫致病性以来，研究表明蚊幼虫是其最主要的靶标(Kellenetal., 1965)。同时有文献报道L.sphaericus对蛇形毛圆线虫Trichostrongyluscolubriformis等具有不同程度的毒性(Boneetal., 1987)；其毒素Mtx1具有杀灭摇蚊Chironomidae幼虫的能力(Partridgeetal., 2002)；而在注射sphaericolysin后，该毒素蛋白能够杀灭德国小蠊(German cockroachBlattelagermanica)及斜纹夜蛾Spodopteralitura( Nishiwakietal., 2007)。除此之外，球形赖氨酸芽孢杆菌还表现出一系列的亚毒性作用包括延缓发育以及降低繁殖能力，但对其他生物却没有有害的影响，例如蜜蜂和真核微生物。目前认为球形赖氨酸芽孢杆菌的毒力作用谱较窄，因此其具有非常良好的安全使用记录(Lacey, 2007)。

2 作用机制

多种球形赖氨酸芽孢杆菌亚株都能产生细菌素和对抗其他亚株的抗生素蛋白(抗菌毒素)(Cetinkayaetal., 2003)。下面的部分将对球形赖氨酸芽孢杆菌的毒性蛋白的相关研究进行综述。

2.1 Sphaericolysin

Nishiwaki等(2007)从DNA II亚群球形赖氨酸芽孢杆菌 A3-2株中分离到了一种名为Sphaericolysin的蛋白毒素，将其注入德国小蠊和斜纹夜蛾体内，能够杀死这两种昆虫。从DNA V亚群球形赖氨酸芽孢杆菌中分离了一种与Sphaericolysin高度同源的一种蛋白毒素，名为胆固醇依赖的细胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysin)( Frometal., 2008)；Sphaericolysin的编码基因同样出现在已经测序完成的球形赖氨酸芽孢杆菌 C3-41株基因组中(Huetal., 2008)。因此，我们有理由认为，编码这种毒素蛋白的基因可能分布较广。研究发现，Sphaericolysi的成熟蛋白是经过剪切掉N端信号肽并分泌到培养基中的一个53 kDa的蛋白(Nishiwakietal., 2007)。它和B.thuringiensis分泌的产气荚膜梭菌素O (Perfringolysin O)和蜂房杆菌溶素(Alveolysin)同属于硫醇细胞溶素超家族。它包括一个类似于胆固醇依赖细胞溶素的模体结构，并且在与胆固醇共同注射时，其灭虫活性显著性降低。通过透射电镜观察发现该毒素和产气荚膜梭菌素O类似，能够使红细胞表面产生许多约35 nm直径的孔洞。总之，已有的研究显示，球形赖氨酸芽孢杆菌能够通过产生和分泌毒素蛋白Sphaericolysin杀死其宿主。

2.2 营养期杀蚊毒素

球形赖氨酸芽孢杆菌在其生长的营养期也会分泌具有昆虫毒性的毒素。目前已经鉴定出两类营养期杀蚊毒素(Vegetative mosquitocidal toxins，Mtx)，根据作用机制可以分为两类：

2.2.1Mtx1蛋白：Mtx1蛋白首先从弱毒性 SSII-1株中鉴定出来，然后发现在强毒性和弱毒性株中都普遍存在，尽管很多都是以假基因的形式存在(Thanabaluetal., 1991)。早在对数生长期该蛋白就开始转录，并且球形赖氨酸芽孢杆菌中mtx1启动子驱动的β-半乳糖苷的生产水平比枯草杆菌低，说明不同宿主中调节元素的活性是有差异的(Ahmedetal.， 1995)。研究发现Mtx1蛋白在球形赖氨酸芽孢杆菌中不仅表达水平较低且不稳定(Myersetal., 1978)，可以被一种枯草杆菌蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶sphaericase所降解(Watietal., 1997)。该酶及其降解Mtx1的活性随后有了进一步研究(Yangetal., 2007)，而在DNA亚群V的球形赖氨酸芽孢杆菌中的Mtx1却有较强的稳定性(Thanabaluetal., 1995)。

Mtx1为一个分子量为100 kDa，N端具有其特征信号序列结构的蛋白，尽管具有信号序列，但没有证据证明其会分泌到培养基中(Thanabaluetal., 1991)。该信号序列的去除有利于重组该蛋白的表达，去除后的重组Mtx1蛋白分子量为97 kDa (Thanabaluetal. 1992)。信号肽样序列下游区域与ADP-核糖基转移酶细菌毒素结构类似。Mtx1会被存在于蚊中肠中的酶﹑胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶水解，产生一个约27 kDa包含有ADP-核糖基转移酶结构的分子和一个约70 kDa包含有内部重复序列的分子(Schirmeretal., 2002a)。这些重复序列为一个凝集素样模体(Lectin-like motif)，其可能参与结合糖基团，因而可能决定了毒素的特异性。Mtx1的晶体结构呈现4个蓖麻毒素B样凝集素功能域环绕着ADP-核糖基转移酶结构域的结构，这种结构可以保护其不被蛋白酶所水解(Treiberetal., 2008)。晶体结构中的活化环暴露可以使其被蛋白酶水解，以便使凝集素结构域调节催化结构域被靶细胞摄取。尽管蚊细胞中Mtx1的靶标仍不清楚，但研究证实Mtx1会修饰致倦库蚊Cx.quinquefasciatus的某些蛋白﹑Hela细胞的几种蛋白﹑E.coli的EF-Tu(Schirmeretal., 2002b)以及大豆胰蛋白酶抑制子，并且都是针对于精氨酸残基进行修饰(Carpuscaetal., 2006)。Mtx1蛋白C端70 kDa区域(包含凝集素重复域)能够引起致倦库蚊和埃及伊蚊Aedesaegypti细胞形态学发生改变。但Mtx1水解后的27和70 kDa区域对于其杀蚊毒性都是必须的(Thanabaluetal., 1993)。在Hela细胞内表达27 kDa的ADP-核糖基转移酶结构域将产生细胞毒性并导致细胞产生肌动蛋白结构类似的丝状伪足(Schirmeretal., 2002b)。

2.2.2Mtx2蛋白：Mtx2蛋白是从SSII-1株中鉴定出来与Mtx1不同的另一类毒素蛋白(Thanabaluetal., 1996)。随后这一家族中的另一成员Mtx3也被报道(Liuetal., 1996)。这些蛋白是成孔毒素家族的成员，属于NCBI保守结构域数据库中的梭状芽胞杆菌ε毒素ETX/MTX2家族。B.thuringiensis同样能够产生类似蛋白，包括Cry15Aa (de Maagdetal., 2003)。Mtx2和Mtx3在营养期就会产生，并且对致倦库蚊和埃及伊蚊都有杀伤作用(Liuetal., 1996; Thanabaluetal., 1996 )。Mtx2毒素蛋白的自然突变会导致对两种蚊种的毒性不一样，224位氨基酸残基被认为在决定靶标时起决定性作用，若该位点为赖氨酸，则表现出对致乏库蚊的毒力更强；若该位点为苏氨酸则表现出对埃及伊蚊的毒力更强(Chanetal. 1996)。Mtx2蛋白的C端对于其溶解性和活可能同样非常重要(Phannachetetal., 2010)。

2.3 Bin毒素

Bin或Binary毒素储存在伴胞晶体中，它们被认为是强灭蚊活性株的特征。该毒素由两种蛋白组成：BinA(370个氨基酸，42 kDa)和BinB(448个氨基酸，51 kDa)。它们由同一个操纵子控制同时转录，在指数生长期以及孢子期之前表达(Ahmedetal., 1995)，若在孢子形成早期进行阻断，则不会积累毒素晶体(El-Bendaryetal., 2005)。不同亚株之间的Bin蛋白非常保守，目前仅报道有5种突变型且任意两种突变型蛋白序列之间不会超过6个氨基酸的不同(Hireetal., 2009)。Bin毒素蛋白家族的其他成员还包括球形赖氨酸芽孢杆菌的Cry49蛋白；B.thuringiensis的Cry35和Cry36蛋白(Jonesetal., 2007)。对幼虫的研究发现，Bin毒素晶体在中肠的碱性环境中溶解，并进行有限的蛋白水解，变成毒性增加的较小分子量的衍生物(Alyetal., 1989, Davidsonetal., 1990)。这一水解过程在易感和不易感昆虫中都会发生(Broadwelletal., 1987)。

最初的毒力作用于昆虫中肠，中毒后的幼虫也会表现出神经核肌肉组织的损伤。在蚊中肠溶解活化后，毒素结合到库蚊胃盲囊和后部中肠的表皮细胞，按蚊的少量局部细胞，而不作用于埃及伊蚊(Davidsonetal., 1988, Oeietal., 1992)。结合至库蚊细胞是由BinB蛋白介导的，其可以独自直接结合到中肠的特定区域的GPI-锚定麦芽糖酶(GPI-anchored maltase, Cpm1) (Oeietal., 1992, Darbouxetal., 2001)。该毒素还能与按蚊细胞的刷状缘膜片段结合，但在冈比亚按蚊Anophelesgambiae中，BinA可以不需要BinB就可以直接结合(Charlesetal., 1997)。该蚊种中的Bin蛋白受体也是与Cpm1直接同源的麦芽糖酶，名为Agm1。在埃及伊蚊的另一个蛋白，与Cpm1和Agm1都高度同源的，但埃及伊蚊却对Bin毒素不敏感，暗示这种作用的特异性可以是由高亲和力的小作用域所决定的，而这种小的作用域在蚊种间却不同源(Opotaetal., 2008)。与受体结合后将会导致细胞死亡，而这一系列反应仍不清楚。研究发现库蚊的细胞被毒素作用后，出现了孔洞。使用人造细胞膜进行试验也得到了相似的结果(Boonsermetal., 2006)。说明Bin毒素的作用是通过在细胞膜上形成孔洞来实现的。将克隆的Cpm1基因转染至哺乳动物细胞后，在Bin毒素的刺激下细胞表现出孔道的开放，液泡的出现，但未发现裂解(Pauchetetal., 2005)。进一步的研究发现Bin毒素作用于这些细胞会导致阳离子通道的开放、毒素与其受体的内化以及大型液泡的产生。这些液泡并不与内化的毒素共位。内化的毒素-受体复合物进入吞噬内体进行降解循环。一种假设是孔道的形成可能被p38 分裂激活蛋白激酶所识别，导致了中肠细胞的自噬。Bin毒素会导致液泡产生，但其自己的移动却是区域化的，并不会迁移至降解细胞器中。每一种Bin蛋白引起的毒性作用的意义目前仍然不清楚(Opotaetal., 2011)。由于这两种细菌毒素的不同性质，引发了一系列对于重组毒素的实验，但这些重组毒素却没有用于野外使用。

3 毒素的协同作用

营养期毒素Mtx1和Mtx2能够协同杀伤埃及伊蚊(Rungrodetal., 2009)。同时，营养生长期的Mtx蛋白与孢子期相关的Bin蛋白也可以联合发挥杀伤作用(Wirthetal., 2007)。在中毒的昆虫中，大多数球形赖氨酸芽孢杆菌在幼虫死亡的时候同时进入营养生长期。因此，营养生长期产生的毒素和Bin毒素可能在自然的球形赖氨酸芽孢杆菌感染过程中相互关联发挥合作效应。Mtx1、Mtx2以及Mtx3是与营养期相关的毒素，并不会被分泌，早期对不产生Bin毒素的SSII-1株的研究提示蚊中肠对细菌的消化可能是使毒素释放的原因之一。球形赖氨酸芽孢杆菌toxins和B.thuringiensis毒素的协同作用也有报道：Mtx1和Cry11A；Mtx2和Cry11A 或Cyt1A；Bin和Cry4A，Cry4B或Cry11A(Wirthetal., 2004; Wirthetal., 2007)。

4 展望

球形赖氨酸芽孢杆菌已经证实可以作为一种野外使用的高效蚊控生物杀虫剂，尽管有一定的耐受出现。处理这个潜在的问题，例如使用重组毒素或与其他杀虫剂(例如B.thuringiensis)交替使用可以维持球形赖氨酸芽孢杆菌杀虫剂的效用。最近20年，对球形赖氨酸芽孢杆菌以及它的昆虫致病性的研究取得了巨大的成就，但仍然存在一些问题未被阐明。虽然我们能够在野外通过使用高密度的孢子来控制该细菌的过度使用，然而对它的自然生态学却是知之甚少。研究其在自然条件下的持久性和回收利用，从而达到自然环境能够接受的最小细菌效量，这将会是一个非常有意义的工作。尽管从分子水平上已经获得了很多关于其毒力作用机制的信息，但很多细节仍然是迷。研究表明Bin毒素可以形成孔道，我们便开始去理解靶细胞为什么会液泡化以及一系列类似的有意义的生理现象。但目前仍未鉴定出Mtx1和Mtx2家族蛋白的受体，蚊细胞中Mtx1的ADP-核糖基化结构的分子作用靶点也有待进一步探索。

重组球形赖氨酸芽孢杆菌或其他表达其毒素微生物的研究可能会使该细菌具有极高的效用，有望在野外降低耐受或延长耐受产生时间。我们对该细菌及其毒素更深入的认识必将更加有利于进一步的开发研究。