基于双向电泳技术的家畜蛋白质组学研究进展

芦方茹，马 云，徐永杰，雷 玲，宋新强

(信阳师范学院 生命科学学院/动物遗传实验室，河南 信阳 464000)

学科动态

基于双向电泳技术的家畜蛋白质组学研究进展

芦方茹，马 云*，徐永杰，雷 玲，宋新强

(信阳师范学院 生命科学学院/动物遗传实验室，河南 信阳 464000)

随着人类基因组计划的完成与落幕，各种家畜如小鼠、牛、猪等的测序工作也相继完成，动物基因组学的研究重点已转向功能基因组学。而蛋白质组学是功能基因组学中非常重要的一部分，作为蛋白质组学研究中经典技术的双向电泳技术就显得尤为重要，论文对双向电泳在牛、猪等家畜中的基础研究进展予以综述，并就蛋白质组学技术的前景加以小结和展望。

双向电泳技术；家畜；蛋白质组学；研究进展

随着技术的革新与发展，生命科学领域也得到了前所未有的变化，全基因组学、转录组学、蛋白质组学、RNA组学等概念应运而生。蛋白质组学(Proteomics)是指一种基因组所表达的全套蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质，其本质是大规模水平研究蛋白质结构和功能的特征。蛋白质组学研究的技术主要包括：质谱分析，X-射线晶体衍射，核磁共振和凝胶电泳。而双向电泳是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合、分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。第一向根据蛋白质等电点(pI)的不同，用等电聚焦电泳分离蛋白质；第二向利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)按蛋白质分子质量的大小对蛋白质进行分离。该方法可在胶片上分离出成千上万种蛋白质多肽，适用于组织与细胞中大规模的蛋白质分离，对于研究蛋白的理化性质如等电点和分子量、蛋白的分离纯化、蛋白表达差异的查找、质谱相结合的手段进行特定蛋白的鉴定等都非常有效，因而是蛋白质组学研究的经典技术手段。近几年来，蛋白质双向电泳在家畜蛋白质组学研究中发挥有非常重要的作用，本文主要就该技术在牛、猪等家畜中的应用研究做一综述。

1 基于双向电泳技术的牛蛋白质组学

牛的产肉和产乳性状一直是人们关注的重点，随着生活条件的改善，牛肉和牛奶的需求日益增加，如何找到提高其产量的内在机制已成为亟待解决的问题。牛蛋白质组学研究为阐明牛的乳质、肉质、妊娠、疾病等提取了较好的研究策略，它有利于人们弄清某种特定蛋白质对于生命活动的功能。

1.1 牛乳质性状相关的蛋白质组学研究

Idoia等[1]以健康奶牛和乳腺炎奶牛的血清和乳清为材料，采用双向电泳耦合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质组学分析，结果发现正常的和乳腺炎乳清中含有不同的成分，如乳运铁蛋白，就只能在发炎的动物样本中检测到。Chevalier等[2]通过使用蛋白质双向电泳和质谱分析技术分离蛋白斑点，观察二向电泳试验结果发现少数高丰度的蛋白质，酪蛋白(αS1-αS2-，β-，κ-，和γ-)，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，血清白蛋白，占原料奶样品蛋白质斑点的绝大多数。同时，当脱脂乳混合物90 ℃加热10 min后，天然乳清蛋白水平降低而二硫键连接的复合物增加。该研究不仅揭示了众多二硫键介导的相互作用，还可用于分析牛奶的还原/氧化和处理后乳制品蛋白质的存储。另外，Holland等[3]在非还原性条件下以牛奶为试验材料进行蛋白质双向电泳，从试验结果中发现κ-CSN(κ-酪蛋白)为复杂的单体模式和二硫键连接的低聚物，对应六聚物单体的斑点参与不同糖型和磷酸化低聚物的形成，并观察到了牛奶中κ-csn的天然分布，对二硫键的作用进行了讨论。Ramona等[4]以商业巴氏消毒和商业的超高温(UHT)牛奶为试验材料进行SDS-PAGE试验，然后进一步通过双向电泳分离牛乳肽，第一向使用ph3-10的胶条，第二向为12%T凝胶。分析试验结果发现UHT牛奶中的蛋白质和肽的数量减少。

Vanderghem等[5]使用蛋白质双向电泳和基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间技术分离鉴定牛奶中的乳脂肪球膜蛋白质组。试验中发现两性离子洗涤剂可以从膜材料中高效回收整合蛋白和外周蛋白；确认了牛奶脂肪球膜中最丰富的蛋白质，并鉴定了牛奶脂肪球膜中的微量蛋白质，进一步实现了蛋白质组的完成。牛丽莉等[6]为了分析产前一周和产后一周奶牛血浆蛋白之间的差异表达，采用了双向电泳技术，包括热SDS法，pH4-7的胶条(17 cm)和梯度凝胶等。共检测出239个蛋白质斑点，其中有12个点在牛血浆蛋白丰度出现超过3倍的变化，其中之一经MADIL-TOF/TOF质谱鉴定为结合珠蛋白，其在产后一周的奶牛血浆中表达增加。该研究发现了产后奶牛的生理变化。

1.2 牛肉质性状相关的蛋白质组学研究

Seo等[7]采用蛋白质组学方法考察与韩国褐牛经济表现相关的遗传标记，使用双向电泳技术分析取自屠宰场的肉类样品的背最长肌，依据大理石花纹得分评价确定了四个候选点：205，84，204和198，这项研究证实了褐牛经济性状育种值和点强度之间的关系。姜昊[8]采用荧光双向电泳结合生物质谱的技术，以中国草原红牛和长白山黑牛眼肌为研究对象，寻找在眼肌中差异表达的蛋白质，结果发现被鉴定的差异表达蛋白可能在脂肪沉积中起到关键性作用，为探索牛肉质性状中脂肪沉积和代谢的分子生物学机制及肉牛的育种改良提供依据。

1.3 牛妊娠时期的蛋白质组学研究

Kim等[9]为了分析、分离牛胎盘蛋白质，对其进行双向电泳试验，等电点范围选择在4.0～7.0和6.0～9.0。试验结果约检测到2000个蛋白质点。MALDI-TOF MS分析后鉴别出273个蛋白质。研究结果发现了牛妊娠后期胎盘复合蛋白质组的关键蛋白，此蛋白质组可能揭示胎盘的功能并协助蛋白质功能分析。Rong等[10]为了找出牛早期妊娠特有的乳清蛋白，对五头怀孕(30和50 d)和五头非怀孕荷斯坦奶牛的奶样进行了蛋白质组学分析，发现其中有12个点发生差异表达，6点显著上调，四点下调，两个点被确定为怀孕特有的蛋白质。这些蛋白质被鉴定为NA-DH脱氢酶亚基2，乳铁蛋白，白蛋白，血清白蛋白前体和铁传递蛋白。这些蛋白将来可能被应用于牛早期妊娠的检测。

1.4 牛疾病感染前后的蛋白质组学研究

Boehmer等[11]为了研究未感染大肠杆菌奶牛和感染大肠杆菌18 h后奶牛的蛋白质组变化，采用蛋白质双向电泳和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析技术鉴定牛奶中差异表达的蛋白质和进行肽测序。该研究为大肠菌群乳腺炎的蛋白调制和这种疾病鉴定过程中的生物标志物提供了一定的依据。边艳杰等[12]为了研究感染结核病牛的牛奶蛋白质组，以类结核病牛的奶样为试验材料进行蛋白质双向电泳试验。通过该试验研究更加敏锐的特定的诊断类结核病的生物标志物。定量分析结果显示主要差异在pH4.5区域，相对于对照组酪蛋白存在于被感染组。

1.5 牛精液蛋白质组学研究

Lee等[13]以韩牛精液为材料进行蛋白质双向电泳试验用以研究精液蛋白质组。第一向使用18cm，ph3-11的胶条；第二向使用12%的丙烯酰胺凝胶；在经过MALDI-TOF MS分析和NCBInr搜索。结果有20个蛋白质斑通过NCBInr搜索进行了肽测序，这些蛋白可能用于为影响雄性韩牛生育能力和提高精液受精能力的蛋白质。

2 基于双向电泳技术的猪蛋白质组学

2.1 猪肉质性状相关的蛋白质组学研究

徐永杰等[14]通过对比各种不同试验方法条件的效果优化了猪肌肉蛋白质双向电泳的主要条件，分析了试验过程中出现的问题。该试验以梅山母猪为试验材料进行蛋白质双向电泳试验，建立了猪骨骼肌组织2-DE及其图谱，为进一步开展猪肌肉相关蛋白质组的研究奠定了基础。

2.2 猪疾病治疗相关的蛋白质组学研究

Lu[15]为了研究菌素诱导的糖尿病小猪和未诱导小猪的冠状动脉支架内(ISR)再狭窄组织的蛋白质变化，对糖尿病和非糖尿病小猪重要的ISR和非ISR段的内膜组织进行双向电泳和MALDI-TOF/TOF质谱分析试验。结果发现无论是糖尿病还是非糖尿病小型猪其AFABP水平在ISR组织比非ISR组织显著增加，且糖尿病ISR的AFABP水平比非糖尿病ISR组织的在的高。总结发现增加人类动脉平滑肌细胞的AFABP表达与分泌AFABP，通过活性氧介导的激活作用，促进动脉平滑肌的生长和迁移。王新洁等[16]建立了猪肝脏蛋白质组双向电泳体系，分别对5种不同的猪肝脏样品进行双向电泳试验并进行了优化，得到了具有统计意义和量分析意义的蛋白点，可用于鉴别不同的猪肝脏样品，且为肝病的诊断、分期、治疗提供了有效依据。

2.3 猪免疫相关的蛋白质组学研究

Wence等[17]为了研究给早期断奶猪补充精氨酸可提高机体的免疫状态和蛋白质的合成的机制，将12只21 d的体重相同的健康仔猪随机分成两组，测试组的仔猪饲养的饲料中添加L-精氨酸的浓度为6.0 g/kg，而项控制组分别饲喂补充L-丙氨酸的浓度为12.3 g/kg(等氮项控制)。7 d后，收集空肠黏膜进行2-D PAGE MS试验分析。结果发现精氨酸调节蛋白质的合成、中间代谢和组织增长，降低了蛋白质水平。

2.4 猪其它方面的蛋白质组学研究

Vidal和Cabezas-Cerrato[18]对猪和牛的晶状体进行研究，经过蛋白质双向电泳试验后，19个蛋白质点中有14个可以重合。这么高的相似度说明了猪和牛的晶状体可能通过相同的方式进行晶状体的翻译后修饰。胡惠忠等[19]为了解卵母细胞的成熟机制，对未成熟和成熟后的猪卵母细胞进行蛋白质双向电泳分析，然后对比分析所得到的两个图谱观察到差异点共有35个，在成熟卵母细胞中有22个表达量上调，13个表达量下调。该试验优化了猪卵母细胞的双向电泳条件，并初步讨论的卵母成熟过程中蛋白质表达的变化。

3 基于双向电泳技术的其他家畜蛋白质组学研究

3.1 羊的蛋白质组学研究

Kiel等[20]为了开发抗蠕虫动物疫苗，对经IgG(免疫球蛋白G)免疫检测所确定的被蛇形毛圆线虫感染的羊进行蛋白质组学分析，使用双向电泳技术对其蛋白质进行分离，及以抗被蛇形毛圆线虫羊血浆为探针进行Western blot，最后用质谱分析法确定免疫反应的蛋白质斑点。结果共识别28个免疫指标，为了解宿主-寄生虫相互作用的分子机制奠定了基础。Pisanu等[21]使用蛋白质双向电泳结合质谱分析的技术对羊奶脂肪球蛋白(MFGPS)进行了研究，通过串联质谱从61个蛋白质斑点的图谱中确定了29个羊奶脂肪球蛋白，并对脱脂乳和乳清进行2-DE/MS，得到了所有主要羊奶蛋白质图谱及其定位。该试验获得了第一个羊MFGPs2-DE图谱，为不同的生理和病理条件下的表达研究奠定了基础。徐铁山等[22]为了研究卵泡蛋白，以绵羊卵泡液为试验材料，对比不同样品制备的方法，构建绵羊卵泡蛋白质组表达图谱，并与血浆蛋白2-DE图谱对比分析。最终发现热的SDS法直接裂解法处理样品得到的图谱效果更好；其蛋白质成分与血浆蛋白质组大致相似，证明了卵泡液是血浆组分跨过血一卵泡屏障转移的产物这一结论。

3.2 狗的蛋白质组学研究

Palviainen[23]收集了四只被蝰蛇咬伤的狗的尿液，对尿样进行蛋白质双向电泳试验，经过图像分析，发现毒蛇咬伤试样组和对照组相比试样组蛋白质点的容积是平均值的1.5倍，在蝰蛇咬伤狗尿液中有7个蛋白显着(P<0.05)过度表达，其中有5个已被鉴定。该试验发现了蝰蛇咬伤改变了狗的蛋白质组。

3.3 兔子的蛋白质组学研究

Jielile等[24]将42只兔子随机分为对照组，固定组，早期运动组，术后石膏固定组和早期运动治疗组，取跟腱样品显微观察并进行蛋白质双向电泳分离蛋白质，首先用软件确认差异蛋白，然后通过使用肽质量指纹图谱，串联质谱和数据库搜索鉴别。这些差异表达的蛋白可能通过生物学力学机制有助于断裂跟腱的愈合。

随着蛋白质双向电泳技术的日益成熟，越来越多的科研人员将蛋白质双向电泳技术应用于各种家畜，研究高产性状，也以各家畜为试验对象研究各种疾病的生物标志物，各种代谢途径的机制等，并取得了一定的研究成果，为人类带来了福音。

4 小结与展望

蛋白质组的研究不仅为生命活动规律提供了物质基础，也为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工具，也能为人类健康事业带来巨大的利益。而蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究的一个主要技术手段，为科研人员从分子生物学方面研究生物提供了许多便利，虽然有些试验没有达到预期结果，但不断有科研人员对各种试验进行优化并从事新的研究，相信不久的将来蛋白质双向电泳可以得到更广泛的应用，在蛋白质组学方面取得更重大的成果。

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ProgressofDomesticAnimalProteomicsBasedonTwo-dimensionalElectrophoresis

LU Fang-ru，MA Yun*，XU Yong-jie，FU Wei-wei,LEI Ling，SONG Xin-qiang

(AnimalGeneticLaboratory,CollegeofScience,XinyangNormalUniversity,XinyangHenan464000)

With the completion of Human Genome Project,a variety of animals,including mice,bovine,pigs and etc,also complete the sequencing.Functional genomics is becoming the focus in animal Genomics research.And proteomes is part of functional genomics.So as the classical technology of proteomes,two-dimensional electrophoresis technology is particularly important.The progress of proteomics about bovine,pig and other domestic animals which based on Two-dimensional electrophoresis was simply discussed in this paper.And proteomics technology was summarized and the prospect of it was also discussed in the end.

two-dimensional electrophoresis; domestic animals; proteomics;progress

2013-05-31，

2013-06-27

国家自然科学基金(31172193)；河南省杰出青年基金项目(134100510012)；河南省高校科技创新人才计划项目(2012HASTIT027)；河南省教育厅自然科学基础研究项目(2011A180027)

芦方茹(1990-)，女，河南许昌人，本科，研究方向：生物科学。

*[通讯作者]马 云(1974-)，男，宁夏平罗人，博士，副教授，研究方向：生物技术与动物遗传育种。E-mail:mayun_666@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0001-04