一种快速提取血吸虫虫卵方法的建立

赵登云，许 瑞，林矫矫,2，陆 珂，洪 炀，李 浩，童来保，赵家喜，朱传刚

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；3.安徽省望江县畜牧兽医局，望江 246000）

一种快速提取血吸虫虫卵方法的建立

赵登云1，许 瑞1，林矫矫1,2，陆 珂1，洪 炀1，李 浩1，童来保3，赵家喜3，朱传刚1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；3.安徽省望江县畜牧兽医局，望江 246000）

为探索一种快速提取血吸虫虫卵并保持虫卵抗原性的方法，本研究用血吸虫尾蚴感染兔并收集其肝脏，分别用不同浓度的NaOH、不同温度和时间消蚀含有虫卵的肝脏匀浆液，以确定最佳提取虫卵条件。通过方阵法确定所提取虫卵的可溶性抗原最佳包被浓度，并对虫卵抗原灵敏度进行了检测。另外，通过测定75份阳性血吸虫水牛血清和60份阴性水牛血清，进一步检测了此法提取并制备抗原的灵敏性。结果表明，本研究所建立的方法在不同NaOH浓度、作用温度和作用时间下，对提取的虫卵均产生影响。NaOH浓度越高，作用时间越久，消蚀温度越高，对虫卵的破坏越显著，表现在虫卵内容物的凝聚和消融，虫卵的空壳化增多。3种不同浓度NaOH 提取虫卵的抗原检测下限分别为1/800、1/1600、1/3200，较过筛法的抗原检测下限1/400有显著提高。对水牛的血清检测结果表明，用NaOH消蚀法提取的虫卵抗原检测血吸虫灵敏性是93%，比常规过筛法高5%，特异性是100%，比常规过筛法高3%。本研究结果表明NaOH消蚀法可快速提取高洁净度的虫卵并保持虫卵的抗原性不被破坏，该法提取虫卵的最佳NaOH浓度是5%～10%，作用温度是45℃左右，作用时间是5～10 min。在最佳条件下制备的虫卵较常规过筛法的纯净度高，虫卵得率也是常规过筛法的3倍以上。

日本血吸虫；虫卵；氢氧化钠；抗原

血吸虫病是一种严重危害人类健康，影响社会经济发展的人畜共患寄生虫病。全球共76个国家和地区流行血吸虫病，感染者超过2亿，近8亿人口面临感染威胁[1]。血吸虫病免疫诊断技术的发展为血吸虫病控制做了重要贡献。目前常用的免疫学诊断方法主要是利用抗原抗体反应原理，用制备好的抗原检测抗体或者是用已知抗体检测抗原[2]。常用的方法为间接血凝实验以及环卵沉淀实验，用到的血吸虫虫卵抗原主要是虫卵可溶性抗原，因此快速提取虫卵并获得虫卵可溶性抗原是血吸虫病诊断的先决条件。传统的过筛法提取虫卵存在耗时长，虫卵损失大的缺点，且纯化后仍有不少肝组织碎片，影响了虫卵的纯度。为解决这一问题，我们通过反复实验，对以往报道的检测虫卵方法加以改进，探索出一种用NaOH消蚀法从动物组织快速提取高纯度虫卵的方法，且对所提取虫卵制备的抗原灵敏性进行了检测。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康新西兰大白兔4只，2.5～3.5kg，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；日本血吸虫阳性钉螺购自江苏省寄生虫病研究所。

1.2 血清标准阴、阳性血清，本实验室保存，阴性血清为非感染血吸虫的新西兰大白兔血清，阳性血清为兔人工感染血吸虫尾蚴42d后收集的血清。待检测水牛血清为60份健康水牛血清，75份人工感染日本血吸虫病牛血清。

1.3 主要试剂NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；pH6.8的PBS缓冲液、ELISA包被液、PBST均由本实验室配制；山羊抗兔酶标二抗购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.4 兔的感染将兔固定在木板上，剃除腹部兔毛，解剖镜下计数日本血吸虫尾蚴，每只兔定量感染1000条尾蚴。

1.5 虫卵计数感染42d后剖杀兔，分别取肝脏，去除胆囊和其他结缔组织，剪成碎块，加适量生理盐水，置组织匀浆仪用8228×g连续绞碎3次，每次1min，间隔1～3min，制成匀浆液。取4只兔肝混合的匀浆液2mL做虫卵计数，其余匀浆液4℃保存备用。虫卵计数方法如下：匀浆液加相同体积10%NaOH置于45℃消蚀2h，然后取100μL光学显微镜下计数虫卵，计数3次。

1.6 虫卵提取匀浆液按下列方案分别提取虫卵，每种方案分别设定3个重复实验，以统计每种方案提取虫卵的效果。

1.6.1 过筛法 定量吸取匀浆液，先后过50目、100目、200目分样筛，收集最后滤液经260目尼龙纱绢集卵，集卵液以514×g 离心3 min，吸出沉淀物上层和中层肝渣部分，留取管底金黄色虫卵部分，加生理盐水洗涤沉淀，经3～5次反复离心分层并除去肝渣，直至呈现金黄色纯净虫卵。加定量PBS后吸取部分虫卵，镜检虫卵纯度及数量。

1.6.2 NaOH消蚀法 分别检测在不同浓度的NaOH、在不同温度及消蚀时间下的提取虫卵效果，各方案如下。

1.6.2.1 不同浓度的NaOH消蚀匀浆液 匀浆液分为3份，分别用5%、10%、20%NaOH同匀浆液按1:1混合后，37℃消蚀1 h，将消蚀匀浆液1157×g 离心5 min，4℃操作，弃上清，加PBS洗涤后离心去上清，重复洗涤3次。镜检虫卵纯度及含量。

1.6.2.2 不同消蚀温度消蚀匀浆液 同上将匀浆液分为3份，用10%NaOH按1:1与匀浆液混合，分别置于37℃、45℃、56℃消蚀1 h，消蚀后洗涤，检测同上。

1.6.2.3 不同消蚀时间消蚀匀浆液 另取匀浆液分为3份，用10%NaOH按1:1同匀浆液混合，56℃消蚀，分别在消蚀5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、1 h收集消蚀匀浆液，1157×g 离心5 min，反复洗涤后镜检，操作同前。

1.7 虫卵可溶性抗原提取将提取的虫卵置研磨器内加适量生理盐水研磨，收集研磨液反复冻融3次，冰上超声：超声1s间隔9s，共1h。15557×g离心5min，取可溶性上清，测OD260和OD280确定抗原浓度，-20℃冻存备用。

1.8 抗原包被浓度确定虫卵可溶性抗原与包被液分别配成5、10、20、40μg/mL四种浓度的工作液，酶标板每孔加入50μL上述工作液，4℃过夜包被；PBST洗2次，用含5%脱脂奶粉的PBST37℃封闭2h；PBST洗2次后每孔分别加入PBST（含5%脱脂奶粉）按1:100稀释的血吸虫标准阴、阳性血清，37℃孵育2h；PBST洗涤后加酶标二抗，37℃孵育2h；PBST洗涤后用可溶性单组份TMB底物溶液显色；2mol/LH2SO4终止显色后测OD450值。

1.9 检测灵敏度按照1.8 方法，抗原包被量为1.8 测定的最佳抗原包被浓度，血吸虫标准阳性血清用PBS进行倍比稀释成1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:64009个滴度的待测血清，阴性对照血清1:100稀释；其余均和1.5 方法一致。

1.10 虫卵抗原敏感性和检出率检测以最佳的ELISA条件分别检测了60份健康水牛血清和75份感染日本血吸虫病水牛血清，每份血清做3个重复，比较两种抗原获得的敏感性、特异性。

1.11 统计分析试验数据用SAS软件进行统计学分析，检验两种诊断方法是否具有显著性差异，P＜0.05为具有显著统计学意义，并计算两种方法的正确诊断指数。

2 结果

2.1 NaOH消蚀法不同参数条件下的提取效果用不同浓度的NaOH同含血吸虫虫卵的肝脏匀浆液混合，置在不同的温度下消蚀不同的时间，分别纯化虫卵进行检测，以纯化虫卵是否有肝脏组织碎片、纯化虫卵的固缩、空壳化以及虫卵 pH值等为比较参数（“-”表示未出现肝杂质、虫卵未出现成串现象、纯化虫卵未固缩或卵未出现空壳化；“+”表示有少许肝杂质、个别虫卵呈现成串、固缩或空壳化；“++”表示肝杂质较多、虫卵成串、固缩或空壳化明显），比较不同条件提取虫卵的效果，结果如表1。

表1 不同浓度NaOH、不同温度、不同时间下虫卵提取效果Table 1 The results of digestion with different concentrations of NaOH at different temperature and different time

综合以上结果，提取虫卵的最佳条件为：NaOH浓度为5%～10%、消蚀温度为45℃左右、消蚀时间为5～10 min。

2.2 消蚀法同过筛法提取虫卵的比较

2.2.1 虫卵得率 提取虫卵前对样品虫卵进行计数，每毫升虫卵数（x±s）为78 497±17 951。过筛法和不同浓度NaOH消蚀法提取的虫卵分别在解剖镜下计数，换算成原有体积下的每毫升虫卵数（表2），过筛法提取虫卵的得率约为NaOH消蚀法提取虫卵得率的1/4，差异具有显著性统计学意义（P＜0.01）；3种浓度NaOH消蚀法提取虫卵得率相当。

2.2.2 镜检 镜下可见收集的高纯度、无损伤的虫卵，与对照组相比，实验组无宿主细胞和组织残留。

表2 不同处理组每毫升虫卵计数统计Table 2 Eggs per milliliter in different treatment group

图1 镜检观察虫卵Fig.1 Microscopic observation of schistosome eggs

2.3 消蚀法提取虫卵用于检测血吸虫病

2.3.1 包被浓度确定 按照检测血清OD450值与阴性对照OD值的比值（P/N）≥2.1标准，判断为阳性，P/N比值最大者确定为最佳抗原包被浓度[3]。用5%NaOH、10%NaOH、20%NaOH处理的虫卵提取的可溶性抗原，其最佳抗原包被浓度为20 μg/mL；过筛法提取的作为对照的虫卵，其可溶性抗原最佳抗原包被浓度为10 μg/mL（图2）。

2.3.2 消蚀法提取虫卵可溶性抗原的检测灵敏度 用3种浓度（5%、10%和20%）的NaOH消蚀肝组织提取的虫卵制备虫卵可溶性抗原，按照检测血清OD450值与阴性对照OD值的比值（P/N）≥2.1标准，以符合P/N≥2.1的最大血清稀释比作为血清稀释下限。检测的阳性血清稀释下限分别是1:800、1:1600和1:3200；而过筛法提取虫卵做的对照实验，检测阳性血清的稀释下限为1:400（图3）。

图2 包被浓度的确定Fig.2 Determination of coating concentration of antigen

图3 5%、10%、20%NaOH消蚀虫卵提取抗原与过筛法提取虫卵抗原的检测灵敏度Fig.3 Detection sensitivity of the antigen extracted from eggs by NaOH digestion at different temperature or by screening method

3.3 虫卵抗原敏感性和检出率按照P/N≥2.1的标准，用NaOH消蚀法在最适合条件下纯化虫卵，提取虫卵可溶性抗原，用最佳抗原包被浓度20 μg/mL包被酶标板，用ELISA法检测现场的牛血清，同过筛法提取的虫卵制备的SEA对比，检测作为ELISA抗原检测家畜血吸虫病的敏感性和检出率，并计算两种诊断方法的正确诊断指数（判断公式：正确诊断指数=1-（假阳性率+假阴性率）），如表3所示。

表3 敏感性和检出率试验结果Table 3 Sensitivity and detection rate of soluble egg antigen from NaOH digestion and screening method

3 讨论

血吸虫病诊断主要有病原学诊断、血清免疫学诊断两种方法。病原学检查粪便检测的灵敏性低，造成的漏检率高，尤其是对于当今血吸虫感染度下降，病原学检测的漏检率可达到50%以上。病原学检查的另一方法是直肠活组织检查，该检查方法需要一定的设备和较高的技术，并且可能引起出血或肠壁穿孔的危险，应用较少。血清免疫学方法是血吸虫病诊断的常用方法，目前常用的检测血吸虫病免疫方法为环卵沉淀法、间接血凝法和ELISA法[4]。其中环卵沉淀法是抗原-抗体反应的一种类型，属沉淀反应，直接将虫卵加入受检血清，利用虫卵内毛蚴的分泌、排出的抗原物质与血清中的相应抗体形成特异的环卵沉淀进行判断；间接血凝法和ELISA法则提取血吸虫虫卵可溶性抗原作为诊断抗原。因此，在血吸虫病的免疫学诊断中，虫卵或虫卵可溶性抗原依然是检测血吸虫病最常用、最灵敏和特异的抗原。

传统血吸虫虫卵提取方法是通过过筛提取，最基本的提取方案：将捣碎的含虫卵肝组织，经50～200目分样筛生理盐水洗过筛，再经260或300目集卵，以除去大部分的肝渣。由于虫卵在肝脏引起虫卵肉芽肿并在虫卵周围形成肝组织纤维化形成结节，过筛法每层分样筛都会造成大量虫卵的丢失。过筛法最后通过反复离心分层，除去上层和中层肝渣，最终获得纯净虫卵。过筛法耗时长，得率低，且纯化后仍有不少肝组织碎片。为了快速获得纯虫卵，一些报道对该法进行了改进，如Coker等[5]等将感染动物处死后至于冰箱中冷藏1～2 d再处理肝脏，增加肝脏的细胞破损，能有效减少后续分离过程中的肝脏组织碎片，有利于提高虫卵纯度，但延长了虫卵分离的时间，难以保持虫卵内活性物质。徐克继等[6]采用分层过滤合并离心分离的方法获得相对纯净的虫卵，但依然耗时长，且纯化后仍有不少肝组织碎片。刘兰英等[7]采用匀浆—分级过滤—中速低温离心沉淀—反复洗涤法的提纯方法，获得的虫卵相对纯净，但纯化过程较繁琐，而且每个高倍镜视野下仍可见肝细胞。周松华等[8]采用反复过筛、加胰酶消蚀并结合离心去上清的纯化法，虽然虫卵分离的较好，肝细胞得到充分粉碎，但该法增加了提取虫卵的时间，且未对提取虫卵的价值进行检测。所以现行报道的各种虫卵收集方法难以达到纯度高、活力高等要求。

强碱如NaOH或KOH溶液具腐蚀性，能迅速吸收组织水分，溶解组织蛋白，皂化脂肪，损坏细胞膜结构，常被用来作为消蚀剂。肝脏主要由肝细胞组成，强碱对其的消蚀作用强烈而快速；在肝脏中沉积的虫卵多数在虫卵周围有结节环绕，虫卵结节主要为组织增生形成的结缔组织，不仅具有一定的韧性，而且通过隔绝虫卵与环境的接触，在强碱消蚀下也对虫卵具有一定的保护作用。此外，血吸虫虫卵的卵壳主要由交联的蛋白质组成，这些交联蛋白非常坚固而且只能通过水解作用被溶解[9]，这些蛋白在酚氧化酶作用下，形成各种交联对虫卵内部卵胚细胞起到保护作用，对外部环境有一定的抗性作用，因此虫卵较肝脏细胞等组织有更强的抗强碱消蚀作用[10-13]。本文尝试采用NaOH消蚀的方法提取虫卵，将含虫卵的肝组织匀浆液直接加入强碱消蚀，省去了过筛步骤，节约了时间；由于肝组织消蚀彻底，离心时上清为肝组织的细胞碎片，不易混入虫卵沉淀，获得的虫卵更加洁净（图1）。从消蚀法提取虫卵的流程及实验最终结果看，消蚀法避免了过筛法由于过筛和离心分层除去肝组织而大量丢失虫卵的可能，虫卵得率较过筛提取法提高近4倍（表2）。

应用消蚀法提取虫卵的条件很重要。在强碱NaOH作用下，作用温度越高，作用所需的时间越短；NaOH浓度越高，消蚀需要的时间也越短。因此控制肝脏匀浆液与NaOH的浓度、作用的温度和作用的时间非常重要。不同浓度的肝脏匀浆液需要加入的NaOH浓度不同，匀浆液越浓稠，需要加入的NaOH浓度越高，因此要控制匀浆液里肝组织的浓度，避免浓度过高，一般情况下，20%的肝脏匀浆液加入10%的NaOH在45℃作用5～10min是最适合的。消蚀后应当快速离心除去NaOH并通过加入pH6.8的PBS反复洗涤的方式减少体系内残余的强碱对虫卵和抗原的破坏。在此条件下，肝杂质、虫卵成串、固缩、空卵壳现象均最少（表1）。

消蚀法提取虫卵制备可溶性虫卵抗原检测血吸虫阳性血清，最适抗原包被浓度下检测抗体的下限（1:3200）较过筛法（1:400）的更低，显示该法提取虫卵作为诊断抗原的灵敏性更高。推测可能是由于消蚀法提取的虫卵纯度更高，提取的虫卵可溶性抗原纯度也相应增高的原因。强碱作用下一些虫卵非可溶性抗原也有可能转化为可溶性抗原，增加可溶性抗原组分提高了检测的灵敏性。应用消蚀法提取虫卵可溶性抗原在检测牛血吸虫病显示了更好的敏感性（93.33%＞88.00%），用SAS软件进行统计分析，显示两种方法做诊断差异没有显著性统计学意义，且消蚀法的正确诊断指数(93.33%)要高于过筛法(84.67%)。

NaOH消蚀法提取虫卵具有操作简便，分离快速，虫卵得率高、纯度好的优点，而且获得的虫卵具有良好的抗原活性，可用于血吸虫病诊断。

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A RAPID METHOD FOR SOLATING SCHISTOSOMA JAPONICUM EGGS

ZHAO Deng-yun1, XU Rui1, LIN Jiao-jiao1,2, LU Ke1, HONG Yang1, LI Hao1, TONG Lai-bao3, ZHAO Jia-xi3, ZHU Chuan-gang1
((1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,
Yangzhou 225009, China; 3. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Wangjiang, Wangjiang 246000, China)

A simple and rapid method for isolating schistosome eggs was developed in the present study. Rabbits were infected with cercariaes and their livers were collected afterwards. The livers were homogenized and treated with NaOH at different concentrations, temperatures and times. The optimal concentration of soluble egg antigen (SEA) for ELISA use was determined by reacting with positive sera of schistosomiasis. Total 75 positive and 60 negative buffalo serum samples were tested to determine the reactivity of SEA extracts. Treatment of liver homogenates with high concentration of NaOH for a long time at the high temperature significantly reduced thereactivity of SEA by causing aggression and ablation of egg contents and increased rate of empty egg shells. The SEA products obtained from liver homogenates treated with 5%, 10% and 20% NaOH reacted in ELISA with positive serum samples diluted at 1:800, 1:1600 and 1:3200, which were lower than the SEA extracted from eggs by mesh method and diluted at 1:400. The results of ELISA showed that the sensitivity and specif city were 93% and 100%, which were 5% and 3% higher than the SEA obtained by mesh method. The optimal conditions to isolate eggs from livers were 5%-10% NaOH at 45℃ for 5-10min. The yield of eggs was almost three times more than conventional mesh method. These results indicated that a large amount of pure eggs could be isolated without loss of antigenicity by using simple and rapid NaOH-maceration method.

Schistosoma japonicum;egg; NaOH; antigenicity

S852.735

A

1674-6422（2014）06-0058-08

2014-07-31

国家公益性行业（农业）科研专项基金（200903036)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2014JB01）

赵登云，女，硕士研究生，兽医学专业

朱传刚， E-mail：zcg@shvri.ac.cn