固相萃取-高效液相色谱法测定酱油专用焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛

黄晓雯，冯笑军

（广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东 广州 510075）

焦糖是一种在食品中应用范围十分广泛的天然着色剂，其主要是用饴糖、蔗糖、葡萄糖等熬成的黏稠液体或粉末，深褐色，有苦味，主要用于酱油、糖果、醋、啤酒等的着色。其中酱油专用焦糖为耐盐焦糖，相当于国际III类焦糖。一般认为，焦糖反应有两种类型：一类是在有胺伴随下的美德拉反应，另一类是在相当高的温度（大约200℃）发生的纯焦糖化反应（单纯地加热葡萄糖的焦化反应）。这2种剧烈反应均会生成5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）和糠醛（furfural）[1]。这2种物质具备增香调色功能，参与生成多种香味物质和深色物质。5-HMF和糠醛若达到一定的剂量时可对人体产生危害。研究表明，一定剂量的糠醛或5-HMF 被机体吸收后，会对呼吸道、肝脏、肾脏、心脏、中枢神经系统等器官产生不良影响；5-HMF还会造成动物横纹肌麻痹和内脏损害[2-3]。

目前，我国仅有GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱一紫外检测法》[4]有关于5-HMF的检测方法，还没有关于广泛食品中的5-HMF和糠醛的标准检测方法。国内研究文献多数使用液相色谱法[2-10]检测，少量报道使用气相色谱（gas chromatogram，GC）[11]、气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）[12]和液质联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）[13-15]进行检测。在食品领域的检测对象主要集中在蜂产品[4，7]、酒类[3，5，8]等。提取的手段主要使用有机溶剂进行提取[2-4，8，12]。未见有关于焦糖中5-HMF和糠醛检测的研究报道。

本研究旨在建立酱油专用焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的分析方法，用于分析2种物质在焦糖中的含量情况，为分析焦糖添加到酱油后5-羟甲基糠醛和糠醛含量变化以及2种物质对增香物质的产生作用提供数据参考。该方法采用亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂固相萃取柱对基质复杂的焦糖样品进行萃取净化，能有效清除焦糖中的极性杂质干扰。结合优化的液相色谱分离条件，5-羟甲基糠醛和糠醛获得良好的分离效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油专用焦糖：市售；糠醛标准品（99%）、5-羟甲基糠醛标准品（99.5%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；OASIS WAX固相萃取柱：美国Waters 公司；本实验所用的水为超纯水。

固相萃取柱：Oasis HLB，500mg，6mL，使用时依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。

1.2 仪器与设备

Alliance2695/2487高效液相色谱仪配紫外可见光检测器：美国Waters公司；Bs210s天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；MS3涡旋振荡仪：广州科仪实验室技术公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液配制：准确称取5-羟甲基糠醛和糠醛各25.00mg，用3mL甲醇溶解，用纯水定容至25mL。所得溶液质量浓度均为1mg/mL。标准工作液使用纯水稀释成适当的质量浓度配制成混合标准溶液。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：SymmetryShield RP18（250mm×4.6mm）；柱温：30℃；流动相为A：水，B：乙腈；洗脱方式：梯度；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：280nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度Table 1 Gradient table of the mobile phase

1.3.3 样品处理

称取焦糖样品0.200g，用水稀释定容至10mL。准确吸取5mL稀释液至活化好的亲水亲油平衡（hydrophilelipophile balance，HLB）柱上，用6mL水清洗，抽真空直到柱子里面的水被抽干，加入5mL甲醇进行洗脱，补加甲醇定容至5mL。静置1h后准确吸取上清液和纯水各1mL，涡旋30s，过0.45μm滤膜，上机待测。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的选择和优化

2.1.1 固相萃取柱的选择

固相萃取柱是利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附，利用不同物质的极性差异使目标化合物与基体干扰物分离，再用洗脱液淋洗达到分离和富集的目的。根据5-羟甲基糠醛和糠醛的结构特点，比较了OASIS HLB 固相萃取柱、C18固相萃取柱和聚合物阳离子交换（polymer cation exchange，PCX）固相萃取柱等的净化效果。分析结果发现，普通C18固相萃取柱由于中间步骤有抽干水的原因，因此对目标物的保留和洗脱效果均不理想；而HLB和PCX柱有聚合物吸附剂，可以抵抗干涸带来的吸附能力的影响。在对HLB柱和PCX柱进行一系列标准溶液试验结果表明，使用HLB柱进行净化，5-羟甲基糠醛和糠醛均有90%以上的回收率（见图1）；而PCX柱2种目标物质均只有80%左右的回收率。因此，选择HLB柱作为本方法固相萃取使用柱。

图1 5-HMF和糠醛在HLB柱上的回收率曲线图Fig.1 Recovery curve of 5-HMF and furfural in HLB cartridge

2.1.2 固相萃取柱净化条件优化

针对固相萃取中的清洗步骤，实验使用纯水、5%和10%体积分数的甲醇水溶液分别进行清洗，测试清洗液中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量。实验结果发现，5%和10%体积分数的甲醇水溶液都会不同程度洗脱出5-羟甲基糠醛，而纯水没有。因此选择纯水作为清洗溶液。针对固相萃取洗脱步骤，分别选用丙酮、乙腈、甲醇作洗脱溶剂。实验发现，3种溶剂都能将5-羟甲基糠醛洗脱下来，但对糠醛的洗脱能力有区别：丙酮＜乙腈＜甲醇。同时，使用甲醇做洗脱剂能使样品杂质沉淀较多而不影响5-羟甲基糠醛和糠醛在洗脱液中的含量，因此选择甲醇作为洗脱剂。

优化后所得固相萃取纯化条件为使用OASIS HLB柱，上样体积为5mL、10mL 纯水洗杂质、5mL甲醇洗脱。图2和图3分别为焦糖样品使用HLB柱净化前和后的效果图。从图2可知，HLB固相萃取柱能较好地清除样品中的杂质，并减少对5-羟甲基糠醛和糠醛的干扰。

2.2 流动相的选择

以水+乙腈、水+甲醇2种流动相体系、采用梯度洗脱和等度洗脱4种条件来对流动相条件进行优化。通过优化实验表明，使用水+乙腈，采用梯度洗脱能使2种物质获得良好的峰形，结果见图4。而且利用梯度洗脱让强极性杂质先洗脱出来，减少基质干扰影响，从而能获得良好的分离度。

2.3 检测波长的确定

在200～300nm范围内对5-羟甲基糠醛和糠醛进行紫外光谱扫描，5-羟甲基糠醛在波长275nm处有最大吸收；糠醛在波长284nm处有最大吸收。为了能同时检测5-羟甲基糠醛和糠醛并让2种物质同时获得较好的响应值，取280nm作为2种物质的检测波长。

图2 焦糖样品未使用HLB柱净化前的色谱图Fig.2 Chromatogram of caramel sample not purified by HLB cartridge

图3 焦糖样品使用HLB柱净化后的色谱图Fig.3 Chromatogram of caramel sample purified by HLB cartridge

图4 5-羟甲基糠醛和糠醛的标准溶液色谱图Fig.4 Chromatogram of furfural and 5-HMF standard solution

2.4 方法的线性范围和检出限

用5-羟甲基糠醛和糠醛混合标准中间溶液100μg/mL分别配制质量浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL标准溶液，在本仪器条件下进行测定，线性方程、线性相关系数见表2。

从表2可知，2种物质在0.5～100μg/mL范围内均获得良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999。按信噪比S/N=3计算5-羟甲基糠醛和糠醛的仪器检出限分别为0.39ng/mL和0.41ng/mL，然后按照本实验方法操作，本方法的最低检出限（limit of detection，LOD）为：5-羟甲基糠醛0.039mg/kg，糠醛0.041mg/kg。

表2 5-羟甲基糠醛和糠醛的线性方程、相关系数Table 2 Linear equations,R2 of 5-HMF and furfural

2.5 精密度和回收率

平行称取18份相同酱油专用焦糖的样品，并向样品添加一定量的5-羟甲基糠醛和糠醛混合标准溶液，按实验方法处理测定，使用外标法定量，并计算回收率，结果见表3。5-羟甲基糠醛和糠醛的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在2.5%～4.6%之间，加标回收率在87.1%～99.2%之间，精密度和回收率均满足方法学定量要求。

表3 精密度与加标回收率试验结果（n＝6）Table 3 Results of precision and recovery rate test

2.6 实际样品的测定

使用本方法对以不同的糖为原料，使用不同工艺方法制成的焦糖进行5-羟甲基糠醛和糠醛含量检测，分析结果详见表4。

表4 不同原料和加工方法的焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量Table 4 Content of 5-HMF and furfural in caramel obtained by different materials and processing methods

从表4可知，相同原料和工艺的不同焦糖中，5-羟甲基糠醛和糠醛的含量变化比较大；相同原料不同工艺的焦糖所含的5-羟甲基糠醛和糠醛含量相差也很大。以同一种糖为原料，使用方法2生产的焦糖相对使用方法1和方法3生产的焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛较低。从实验结果看，不同的原料和加工方法会对焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的生成有影响作用，其影响程度和生成机理以及对酱油的影响仍需进一步研究探讨。

3 结论

采用亲水亲脂平衡的水可浸润性反相吸附剂固相萃取柱OASIS HLB对酱油专用焦糖进行净化，采用高效液相色谱法进行检测，建立了定量测定酱油专用焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量方法。本方法在0.5～100μg/mL范围内线性关系良好，R2＞0.999，RSD（n=6）在2.5%～4.6%之间，加标回收率在87.1%～99.2%之间，5-羟甲基糠醛和糠醛的方法检出限（LOD）分别为0.039mg/kg和0.041mg/kg。方法学试验结果表明其具有灵敏度高、重现性好、干扰杂质少的特点，能满足企业对原料进行检测监控的需要。为分析原料和加工方法对焦糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的影响以及对添加到酱油后的影响和芳香物质的变化的研究提供可靠的试验方法和研究数据。

[1]张玉玉，宋 弋，李全宏.食品中糠5-羟甲基糠醛的产生机理、含量检测及安全性评价研究进展[J].食品科学，2012，33（5）：275-280.

[2]王妙飞，张水华，郭新东，等.高效液相色谱法测定酱油中的5-羟甲基糠醛[J].现代食品科技，2008，24（2）：188-190.

[3]彭 宁，黄雪松.高效液相色谱法测定黄酒中的5-羟甲基糠醛[J].食品科学，2009，30（24）：369-371.

[4]人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.GB/T 18932.18—2003 蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法液相色谱一紫外检测法[S].北京：中国标准出版社，2003.

[5]王建刚，李 丽.反相高效液相色谱法测定白酒中糠醛[J].理化检验（化学分册），2010，46（12）：1470-1471.

[6]石起增，杨光瑞，刘巧茹.反相高效液相色谱法测定糠酸、糠醇和糠醛[J].分析试验室，2006，25（6）：73-74.

[7]吴黎明，田文礼，薛晓锋，等.高效液相色谱法测定蜂王浆中羟甲基糠醛含量[J].食品科学，2008，29（3）：412-414.

[8]杨朝霞，李 梅，董建军，等.高效液相色谱同时测定啤酒中的5-羟甲基糠醛和糠醛[J].酿酒科技，2006（9）：88-90.

[9]康春莉，唐晓剑，于宏兵，等.高效液相色谱法测定糠醛废水中的糠醛含量[J].工业水处理，2007，27（6）：67-68.

[10]张根林，班丽丽，邓 辉，等.高效液相色谱法测定棉秆水解液中苯酚和糠醛[J].理化检验（化学分册），2011，47（10）：1192-1194.

[11]潘春梅，孙西玉，樊耀亭.气相色谱法测定秸秆水解液中的糠醛和乙酸含量[J].酿酒科技，2008，167（5）：108-110.

[12]林晓珊，黄晓兰，吴惠勤，等.气相色谱-串联质谱法快速测定调味品中3 种糠醛类物质[J].分析测试学报，2012，31（11）：1345-1351.

[13]王云凤，常春艳，葛宝坤.饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的液相色谱-质谱测定方法[J].中国卫生检验杂志，2007，17（5）：841-842.

[14]张 燕，郭天鑫，于 姣.离子交换固相萃取高效液相色谱联用法检测食品中的5-羟甲基糠醛[J].食品科学，2010，31（18）：212-215.

[15]艾则孜，穆合买提，贺玖明，等.中药注射液中5-羟甲基糠醛含量测定的LC-MS/MS 分析方法研究[J].药物分析杂志，2010，30（7）：1195-1198.