贵人香冰酒大生产过程中酵母菌群结构及动态变化

何 娟，曹培鑫，黄英子，刘延琳*

（1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

冰酒（icewine）即冰葡萄酒，指环境温度达到-8℃以下，葡萄在葡萄树上自然冰冻，此时葡萄中的一部分水分蒸发，一部分结冰，葡萄汁的糖、酸得到浓缩，风味、香气变浓，将这种葡萄采摘、压榨，流出少量浓缩的葡萄汁经低温保糖发酵而成的葡萄酒[1]。冰酒因其独特、浓郁、甜香醇厚的风味，漫长的酿造过程而身价倍增，被誉为“液体黄金”。

冰酒的发酵过程是一个复杂的微生物动态变化及生化过程，包含了不同酵母属种此消彼长的变化，研究发酵不同阶段酵母菌的消长规律，有利于冰酒发酵过程中的微生物控制，也为研究酵母菌对葡萄酒风味的影响提供依据[2]。冰酒原料的高糖、高酸环境及其发酵过程要求的低温等特殊环境对发酵过程酵母动态变化有重要影响[3]。

我国作为世界少有的冰酒酿造国之一，有关我国冰酒酵母资源的研究意义重大。本研究通过采用甘肃祁连酒庄冰酒主栽品种贵人香（Italian Riesling）为对象，监测冰酒大生产发酵过程中酵母菌菌群的多样性和动态变化。利用WLN营养琼脂、26S rDNA D1/D2区域的多态性和Interdelta序列指纹图谱分析对发酵过程中不同阶段分离的酵母进行分类鉴定，跟踪商业酵母在冰酒发酵过程中的变化及其与野生酵母的竞争状况，有利于明确商业酵母是否在严苛的冰酒发酵过程中取得优势地位，为冰酒发酵过程中的微生物控制和冰酒风味改良与提升提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

于2011年11月从甘肃祁连葡萄酒有限公司葡萄基地采集酿造冰白主栽品种贵人香（糖度35°Bx，总酸8.1g/L），于60kL的圆柱形不锈钢发酵罐发酵酿造冰白葡萄酒，在大生产中分离酵母180株进行分类鉴定。

商业酵母LVCB：荷兰DSM公司。

1.2 培养基

菌株的分离培养采用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）[2]；菌株的初步形态分类采用WLN（Wallerstein laboratories nutrient）营养培养基[4]。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离

贵人香葡萄采收后，除梗、破碎、取汁，均匀加入60mg/L的SO2，葡萄汁澄清后，按2×106CFU/mL接入商业酵母LVCB，控温12～16℃。在发酵过程中，分别于接种前、接种后、起酵时、糖消耗1/4、糖消耗2/3、终止发酵六个时期取样1mL，用无菌水稀释至合适梯度，取100μL涂布于YEPD平板上，加入100mg/L氯霉素抑制细菌生长，28℃倒置培养3d，每个时期共挑取单菌落30个，于20%甘油中-20℃保藏。

1.3.2 WLN培养基聚类分析

将分离到的180株菌，于YEPD培养基活化12h后，接种于WLN培养基上，28℃倒置培养5d，观察并记录菌落颜色和形态，参照PALLMANN C L等[4]中方法进行聚类分析，进行26S rDNA D1/D2区序列的分子鉴定补充，对得到的酿酒酵母进行Interdelta指纹图谱分析。

1.3.3 DNA提取

采用石英砂破壁提取法[5]。

1.3.4 26S rDNA D1/D2区域PCR扩增

使用引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）进行26S rRNA D1/D2区的扩增[6]。PCR反应体系（50μL体系）：10×PCR buffer 5μL；25mmol/L MgCl23μL；10mmol/L dNTP 1μL；10μmol/L引物各1μL；Taq酶1.5U，l0ng～lμg/μL模版DNA 1μL；最后加双蒸水定容至50μL。PCR循环为：95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min 20s；循环36次；72℃保温8min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序分析。

1.3.5 Interdelta序列扩增

采用正向引物delta12（5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′）和反向引物delta21（5′-CATCTTAACACCGTATATGA-3′）进行扩增反应[7]。扩增体系为50μL：1×PCR buffer；2.5mmol/L MgCl2；0.2mmol/L dNTP；引物δ12和δ21各为0.2mmol/L；Taq酶0.08U；模版DNA（l0ng/L～lμg/μL）；加灭菌双蒸水定容至50μL。扩增反应条件：95℃4min（预变性）；94℃30s（变性），46℃30s（退火），72℃1min 30s（延伸），循环35次；72℃10min（补充延伸）。

扩增产物经2%琼脂糖凝胶检测（电泳时间为2h），之后置于凝胶成像仪内拍照。

1.3.6 数据处理

将测序得到26S rDNA序列结果经BLAST软件分析及序列相似性计算。对Interdelta指纹图谱的带型进行人工读带并统计，将特定位置上有DNA条带的计为1，无DNA条带的计为0，对酿酒酵母进行基因型。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中酵母菌的种类及其数量变化

冰酒大生产发酵过程中共分离菌株180株，其中6株由于保存不当被污染，剩余174菌株通过WLN营养培养基的培养后，根据菌落颜色和形态的不同，可初步聚为12类（见图1），参照PALLMANN C L等[4]、杨莹等[8-9]描述的WLN分类鉴定结果和26S rDNA D1/D2鉴定表明，所获酵母菌分属于9属10种（见表1）：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、核果梅奇酵母（Metschnikowia aff.Fructicola）、柠檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）、嗜高压有孢汉生酵母（Hanseniaspora osmophila）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans）、浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），分别占到了分离总菌株的86.21%、0.57%、2.87%、4.60%、1.15%、1.15%、1.15%、0.57%、0.57%、1.15%。其中，非酿酒酵母24株，酿酒酵母150株。菌落类型D（K.apiculata）有D1和D2两个不同形态；菌落类型J（H.uvarum）有J1和J2两个不同形态。各个时期酵母菌种群分布及其动态变化见表2。

由表2可知，接种前S.cerevisiae的比例高达63%，这可能包括酒厂设备上的常用商业酵母的及部分野生酵母，同时也包含分属5属5种的具有高糖耐受性的非酿酒酵母；接种后，S.cerevisiae的比例已达到81.5%；随着发酵进行，发酵液中酒精含量不断增加，S.cerevisiae比例逐渐升高达到90%以上，此时大量非酿酒酵母由于酒精耐受性不够而大量死亡[10]，而发酵末期还存在少量高耐酒精孢圆酵母（T.delbrueckii），发酵毕赤酵母（P.fermentans）。

2.2 发酵过程中酿酒酵母的菌株变化

从150株酿酒酵母中选取85株Interdelta序列扩增后，得到2种基因型分别为已接种的商业酵母LVCB（Ⅰ）和1种野生酵母（Ⅱ）（见图2）。发酵过程中各个时期酿酒酵母各基因型的动态变化（见表3）。在冰酒大生产发酵过程中，接种前有66.7%的商业酵母LVCB存在可能是因为酒厂常年使用LVCB酿酒，致使部分商业酵母LVC残留于车间地面、酿酒设备、空气等。而野生酵母多样性不丰富，这可能跟冰酒原料高糖、高酸环境对酵母生长产生的严苛条件有关。商业酵母基本主导了整个冰酒发酵，在发酵中后期更是成为绝对的发酵优势菌，但是野生酿酒酵母在发酵初中期都表现出了竞争的潜力。

图1 12株酵母在WLN培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of twelve yeast species on WLN medium

表1 大生产发酵中分离菌株的WLN形态描述及鉴定Table 1 Morphological descriptions and identification of yeast colonies on WLN medium isolated from industrial fermentation

表2 发酵各阶段酵母菌种类、数量和比例Table 2 Species,quantity and proportion of yeast during different fermentation stages

表3 酿酒酵母各基因型在发酵过程中的分布和比例Table 3 Distribution and proportion of S.cerevisiaein genotypes during different fermentation stages

图2 酿酒酵母的Interdelta图谱Fig.2 Interdelta sequence of S.cerevisiaein

3 结论

我国冰酒酿造所用酵母大多为国外引进商业酵母，而有关商业酵母能否在严苛的冰酒发酵过程中取得优势地位且冰酒发酵过程中酵母菌种群及动态变化研究甚少。本研究通过对甘肃祁连贵人香冰葡萄酒大生产发酵过程中酵母菌群的动态变化研究，分离到的酵母菌分属9属10种，除了常见的葡萄酒相关酵母外[11-13]，还发现了Metschnikowia aff.Fructicola、Hanseniaspora osmophila、Cryptococcus albidus等不太常见的非酿酒酵母。这些非酿酒酵母的存在是否与冰酒特殊环境及此地区地理环境有关还需进一步的研究。此外，在菌株水平上对S.cerevisiae进行区分，得到接种的商业酵母及一种野生酵母，并证实商业酵母基本主导了整个冰酒发酵，但是野生酿酒酵母在发酵初中期都表现出一定的竞争潜力。与其他地区大量的野生酵母资源相比[14-16]，本实验分离得到的酿酒酵母少，这可能跟冰酒发酵的高糖、高酸、低温环境及商业酵母对本土酵母的排挤作用有关。

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