银川市市售食品中单增李斯特菌污染状况分析研究

乌日娜，刘 翔，郭邦成，闫立群，张玉平

(1.北方民族大学生命科学与工程学院，宁夏银川 750021;2.宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏银川 750004)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM，单增李斯特菌)是一种重要的极具威胁的食源性病原菌。该菌在环境中无处不在，主要通过食物传播［1］。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。李斯特菌病是经进食被单增李斯特菌污染的食物而引起的一种严重的食源性疾病，易感人群包括老年人、孕妇、新生儿和免疫功能障碍者，该病的致死率高达30% ～70%［2］。国内外各地食源性致病菌监测结果表明，食品中单增李斯特菌的污染普遍存在，受污染的食物种类繁多，涉及生肉类、动物水产品、熟肉制品、速冻米面食品、蔬菜等食品，极有可能导致李斯特菌病和构成潜在流行的威胁［3］。鉴于此，积极进行全国范围内食品中单增李斯特菌的污染状况研究十分必要。不同地区使用抗生素种类不同，导致了当地致病菌的耐药种类和特性也必然不同。研究各地区食品中单增李斯特菌的耐药特性，对于李斯特菌病的预防和治疗意义重大。目前，对于宁夏银川市食源性单增李斯特菌的耐药情况还尚未见研究报道，笔者对银川市市售食品中单增李斯特菌的污染情况、血清型和抗生素敏感性进行分析，以期能为预防控制食源性单增李斯特菌的爆发流行、追踪溯源和临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。2012年10月至2013年9月期间在银川市3个区(金凤区、西夏区和兴庆区)的农贸市场和超市进行取样，每个区选取2家农贸市场和1家超市，其中每个农贸市场选取2个摊位。严格按照取样计划，每月采集样品60份，样品共计720份，包括生羊肉(145份)、生牛肉(145份)、生猪肉(120份)、生鸡肉(120份)、动物性水产品(70份)和速冻米面制品(120份)。其中肉类采样包括常温、冷鲜和冷冻贮藏样品。

1.1.2 试验菌株。标准菌株:单增李斯特菌ATCC19112，购自中国医学细菌保藏中心;药敏质控菌株:金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希氏菌ATCC2922，由宁夏自治区疾病预防控制中心提供。

1.1.3 主要试剂与培养基。单增李斯特菌用LB1、LB2增菌液，北京陆桥技术有限责任公司;PALCAM琼脂基础及添加剂、单增李斯特菌显色培养基、TSA-YE、木糖及鼠李糖发酵管、SIM动力培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司;MH血琼脂平板CP0220A，广东环凯微生物科技有限公司;抗生素药敏纸片，QXOID英国公司;API Listeria生化鉴定条，生物梅里埃公司。

1.1.4 主要仪器设备。麦氏比浊仪，法国梅里埃生物公司;电热恒温培养箱，南京试验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 单增李斯特菌分离鉴定方法。按照2012年《国家食源性疾病监测网工作手册》［4］，同时参考GB4789.30-2010《单核细胞增生性李斯特氏菌检验》［5］进行样品的分离和菌株鉴定。

1.2.2 血清分型试验方法。按照单增李斯特菌血清使用说明书，用单增李斯特菌血清，通过玻片凝集法(O抗原)和试管凝集法(H抗原)进行血清分型。

1.2.3 药敏试验方法。抗生素种类参照美国国家临床实验室标准委员会推荐的单增李斯特菌药敏试验抗生素选择原则和临床治疗常用抗生素确定。共选择21种抗生素:庆大霉素(CN)、亚胺培南(IMP)、氯霉素(C)、多粘菌素(PB)、头孢噻吩(KF)、头孢噻肟(CTX)、链霉素(S)、复方新诺明(SXT)、诺氟沙星(NOR)、利福平(RD)、四环素(TE)、红霉素(E)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、强力霉素(DO)、氨苄西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、新生霉素(N)、青霉素(P)、呋喃妥因(F)、环丙沙星(CIP)、万古霉素(VA)。药敏结果判定标准按照NCCLs手册2005版。药敏试验采用世界卫生组织(WHO)及美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片扩散法进行。

1.2.4 数据统计分析。试验数据采用spss13.0软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 各类食品中单增李斯特菌的污染情况 银川市各类食品中单增李斯特菌污染情况见表1。由表1可知，720份食品中检出单增李斯45株，总检出率为6.25%，其中污染率最高的是生鸡肉(8.33%)，其次为生猪肉和速冻米面制品(7.50%)，之后依次为动物性水产品(5.71%)、生牛肉(4.83%)和生羊肉(3.45%)。不同食品中单增李斯特菌检出率无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 不同季度食品中单增李斯特菌的污染情况比较 对4个季度食品中单增李斯特菌的检出率进行统计，具体情况见表2。4个季度中第3季度检出率最高，为13.89%;其次为第2季度，检出率为6.67%;第4季度检出率最低，为0.56%。各季度单增李斯特菌检出率有显著性差异(P＜0.01)。

表1 各类食品中单增李斯特菌的检出率

表2 各季度食品中单增李斯特菌的检出率

2.3 不同贮藏温度食品中单增李斯特菌的检出情况 除了速冻米面制品外，所检测的生肉类和动物性水产品共计600份样品，均包括常温、冷鲜和冷冻贮藏样品。常温样品反映了当地实际气候的温度，冷鲜肉温度控制在-4℃。生猪肉没有采集冷冻样品，动物性水产品均为冷鲜或冷冻贮藏。结果表明，3种贮藏温度中冷鲜样品中单增李斯特菌检出率最高，为10.77%，冷冻次之(5.56%)，常温肉品检出率最低(3.50%)，不同储存条件有显著性差异(P＜0.05)。从具体的食品种类来看，各类食品在不同贮藏温度下单增李斯特菌的污染情况不同，具体见表3。

表3 不同贮藏温度各类食品中单增李斯特菌的检出率

由表3可知，对于生牛肉和生羊肉样品，常温和冷鲜均未检出单增李斯特菌，仅冷冻样品有，检出率均为7.06%，且二者在所有冷冻样品中单增李斯特菌的检出率较高。冷鲜肉品中冷鲜鸡肉单增李斯特菌检出率最高(25.00%)，动物性水产品和生猪肉的检出率均为10.00%。常温样品中生猪肉检出率最高(6.25%)，其次是生鸡肉(5.00%)。

2.4 超市和农贸市场食品中单增李斯特菌的检出情况比较 农贸市场采集生肉样共计270份，检出单增李斯特菌的阳性样本有10个，检出率为3.70%;超市采集生肉样330份，检出单增李斯特菌26个，检出率达7.88%。不同来源市售肉品中单增李斯特菌的检出率有显著性差异(P＜0.05，χ2=4.590，P=0.032)。

2.5 单增李斯特菌血清学分型结果 45株食源性单增李斯特菌共分为5 个血清型(1/2a、1/2b、1/2c、4b 和 4a)，1/2a 型为主要血清型，占 46.67%(21/45);其次为 1/2c型(44.44%，20/45)、1/2b(2.22%，1/45)、4b(2.22%，1/45)、4a(4.44%，2/45)。5种血清型中1/2a型分布最广，在所有种类样品中均有检出，1/2c型仅在熟肉制品中未检出，致病性较强的4b型分离自生鸡肉中，1株1/2b型分离自速冻米面制品。

2.6 单增李斯特菌药敏试验结果 45株单增李斯特菌进行21种抗生素的药敏试验，结果表明，有37株单增李斯特菌对7种抗生素存在耐药，总耐药率为82.22%(37/45)，其中耐多粘菌素就有35个，耐药率为77.78%(35/45)，其次是头孢噻肟、四环素、呋喃妥因、青霉素、红霉素和头孢噻吩，耐药率分别为 28.89%(13/45)、13.33%(6/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)和 2.22%(1/45);链霉素、强力霉素和氯霉素药敏处于中介，中介率分别为11.11%(5/45)、6.67%(3/45)和4.44%(2/45)。对诺氟沙星、利福平、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、复方新诺明、氨苄西林、左氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、万古霉素和亚胺培南全部敏感。37株耐药菌株中，单一耐药的菌株有18株，其中耐多粘菌素有16株，双重耐药10株，三重耐药8株，四重耐药1株。

3 讨论

近年来，国内外的研究人员纷纷对不同食品中的单增李斯特菌污染状况进行了研究。全球各地食品中均有不同程度的单增李斯特菌污染，其中生肉中单增李斯特菌的污染情况最严重［6-13］。该研究结果显示，生鸡肉中单增李斯特菌检出率最高，为8.33%;其次是生猪肉和速冻米面制品;动物性水产品、生牛肉和生羊肉中检出率较低。这提示生肉类是该地区重点食品卫生监测种类，尤其是鸡肉、猪肉和速冻米面制品。生牛肉和生牛羊肉中单增李斯特菌的污染情况最轻，检出率比一些研究报道均低［14-15］，其原因除了宁夏清真牛羊肉卫生质量管理因素之外，还与清真牛羊肉独特的屠宰加工方式有一定关系。

该研究对4个季度食品中单增李斯特菌污染结果分析可知，污染情况最严重的是第3季度，该季度也是一年中温度最高的季度，接近单增李斯特菌的最适生长温度，一旦食品被其污染大量繁殖后，出现食品间交叉污染的几率更大，故检出率最高。低温对许多致病菌的生长具有抑制作用，但单增李斯特菌却可耐受低温，低温环境下可以生长，故在温度较低的第1季度和第4季度仍可检出单增李斯特菌。

该研究对不同贮藏温度下生肉中单增李斯特菌污染情况做了调查，冷鲜肉品中单增李斯特菌检出率最高，为10.77%，冷冻次之(5.56%)，常温肉品检出率最低(3.50%)。其中常温生牛肉和生羊肉未检出单增李斯特菌。结果表明，最令人们放心的冷鲜肉单增李斯特菌的污染程度最高，其卫生安全很不乐观，同时传统意义上较为安全的冷冻肉中单增李斯特菌的污染程度也较高，这是因为此致病菌对低温有较强的耐受性，使得冷冻食品在冰箱中交叉污染的机会增加，提醒人们购买冷冻食品应充分加热后再食用。该研究发现，虽然在常温和冷鲜生牛羊肉中未检出单增李斯特菌，但冷冻牛羊肉制品如冷冻牛羊肉卷、牛羊肉片的单增李斯特菌检出率却较高，其原因可能是在冷冻牛羊肉制品生产和贮藏过程与其他食品交叉污染，或是加工设备本身带菌造成的，提示在冷冻肉制品加工过程中及时清洗相关设备，避免交叉污染的可能性。同时也提示消费者在涮牛羊肉或是爆炒时注意延长时间，达到充分杀菌的目的。

该研究对不同来源生肉和动物性水产品中单增李斯特菌的检出率进行统计，结果显示，超市来源肉品中单增李斯特菌检出率较高，这说明超市肉品的卫生质量状况不容乐观，存在严重的安全隐患，提示相关部门应加强超市的卫生管理。

银川市45株单增李斯特菌共分为5种血清型，其中1/2a和1/2c型是主要的血清型，该结果与其他相关研究报道基本一致［16-17］。此外，对于致病力强的1/2b型在速冻米面制品中检出，4b型在生鸡肉中检出，且都是耐药菌株，1/2b型对多粘菌素耐药，4b型对多粘菌素和头孢噻肟双重耐药。提示人们应针对相关食品进行重点监督和监测工作，防止交叉污染或烹调不当导致食物中毒的发生。

耐药性试验结果显示，45株单增李斯特菌有37株耐药，耐药率为82.22%，与我国其他地区相比，耐药情况严重，远高于其他地区的水平［16-18］。所耐受的7种抗生素中，耐多粘菌素最严重，这也是导致宁夏单增李斯特菌菌株整体耐药率与没有检测该抗生素的地区相比较高的主要原因。银川市单增李斯特菌与其他地区的菌株一样对四环素、头孢类抗生素和红霉素均产生一定的耐药性，但对临床一线药物氨基青霉素、氨基糖苷类和喹诺酮类均未出现耐药情况。生猪肉和生鸡肉中的单增李斯特菌耐药情况最严重，这与哈尔滨市［14］的情况一样，而宁夏人民喜食的牛羊肉中单增李斯特菌的耐药情况较为乐观，尤其是生羊肉中单增李斯特菌的耐药率最低，且都是单一耐药。

该研究及国内外单增李斯特菌的污染状况调查报告提示人们应高度重视该致病菌，健全食品监测网，及时发现和掌握我国食源性致病菌污染程度和污染分布特点，积极加强致病菌耐药性监测，获得当地菌株的耐药信息，提高食源性疾病的预警与控制能力。

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